Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento
Summary
Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.
Abstract
A análise de DNA do tumor (ctDNA) usando o sequenciamento de próxima geração (NGS) em circulação tornou-se uma valiosa ferramenta para o desenvolvimento da oncologia clínica. No entanto, a aplicação deste método é um desafio devido à sua baixa sensibilidade ao analisar a quantidade de rastreamento de ctDNA no sangue. Além disso, o método pode gerar resultados falsos positivos e negativos a partir desta análise de sequenciamento e subsequente. Para melhorar a viabilidade e a confiabilidade da deteção de ctDNA na clínica, aqui apresentamos uma técnica que enriquece raras mutações por sequenciamento, enriquecer a rara mutação sequenciamento (ER-Seq). ER-Seq pode distinguir uma única mutação fora 1 x 107 nucleotídeos de tipo selvagem, que o torna uma ferramenta promissora para detectar alterações genéticas extremamente baixa frequência e, portanto, será muito útil no estudo de heterogenicity doença. Em virtude da ligadura do adaptador exclusivo de sequenciamento, esse método permite uma recuperação eficiente de moléculas de ctDNA, ao mesmo tempo corrigindo para erros bidirecionalmente (sentido e antisentido). Nossa seleção de sondas 1021 kb enriquece a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações em 12 tumores relacionados ao tumor motorista. Esse método cost-effective e universal permite uma acumulação excepcionalmente bem sucedida dos dados genéticos. Depois de forma eficiente filtragem de erro de fundo, ER-seq precisamente pode detectar mutações raras. Usando um estudo de caso, apresentamos um protocolo detalhado demonstrando sonda design, construção de biblioteca e metodologias de captura de DNA alvo, enquanto incluindo também o fluxo de trabalho de análise de dados. O processo para realizar este método normalmente leva 1-2 dias.
Introduction
Sequenciamento de próxima geração (NGS), uma poderosa ferramenta para investigar os mistérios do genoma, pode fornecer uma grande quantidade de informações, que podem revelar alterações genéticas. A aplicação da análise NGS na clínica tornou-se mais comum, especialmente para a medicina personalizada. Uma das maiores limitações da NGS, no entanto, é uma taxa de erro elevada. Embora considera-se adequado para estudar as mutações herdadas, a análise de mutações raras é extremamente limitada1,2, especialmente quando analisar o DNA obtido de uma biópsia”líquida”.
Tumor de circulação DNA (ctDNA) é sem célula DNA (cfDNA) no sangue que é derramado de células tumorais. Na maioria dos casos, a quantidade de ctDNA é extremamente baixa, que tornam sua deteção e da análise muito desafiador. No entanto, o ctDNA tem muitas características atraentes: seu isolamento é minimamente invasivo, ele pode ser detectado na fase inicial de crescimento do tumor, o nível de ctDNA reflete a eficiência terapêutica e ctDNA contém as mutações de DNA encontradas em lesões primárias e metastáticas 3 , 4 , 5. portanto, tendo em conta o rápido desenvolvimento da técnica NGS e análise, a aplicação da deteção de ctDNA tornou-se mais atraente.
Sequenciamento em paralelo diferentes abordagens têm sido utilizadas para a deteção de ctDNA, mas nenhuma dessas abordagens foram aceites para uso rotineiro em clínicas devido às suas limitações: baixa sensibilidade, falta de versatilidade e um custo relativamente alto6 ,7,8. Por exemplo, sequenciamento de frente e verso, baseado em uma marca de identificador exclusivo (UID), repetidamente corrige erros em bidirecionalmente o consenso, a maioria dos erros de sequenciamento de rectificação. No entanto, a viabilidade desse método é perdida devido ao seu alto custo e utilização de dados baixa9,10. Da mesma forma, CAPP-Seq e sua iteração melhorada, CAPP-IDES11,12, têm maior praticidade na detecção de cfDNA, embora a precisão e a universalidade desses métodos precisam ser melhoradas.
Para atender a necessidade atual para detecção de ctDNA precisos e análise, desenvolvemos uma nova estratégia, enriquecer a rara mutação de sequenciamento (ER-Seq). Esta abordagem combina o seguinte: adaptadores de sequenciamento exclusivo para recuperar com eficiência ctDNA moléculas, com correção de erro bidirecional e a capacidade de distinguir uma única mutação de > 1 × 107 nucleotídeos de tipo selvagem; sondas de 1021 kb que enriquecem a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações relacionados ao tumor de 12 tumores, incluindo câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de colo uterino, câncer de esôfago e carcinoma de endométrio (tabela 1); e triagem de banco de dados de base tornando-o eficiente e fácil de detectar precisamente mutações raras em ctDNA.
Para construir um banco de dados de base, encontre todas as mutações do gene por ER-Seq de um número do mesmo tipo de amostras (~ 1000 no início). Estas mutações reais devem ser verificadas por vários outros métodos de deteção de confiança e análise. Em seguida, resumem o padrão de mutações falsas e todas as mutações falsas para criar o banco de dados de base inicial de cluster. Continue a adicionar falsas mutações encontradas de experimentos subsequentes sequenciamento a esse banco de dados. Portanto, esse banco de dados de base torna-se uma dinâmico expandido de banco de dados, que melhora significativamente a precisão de sequenciamento.
Para promover o progresso na monitorização e diagnóstico de tumor, apresentamos ER-Seq, um método de baixo custo e viável para a aquisição de dados universais. Apresentamos um estudo de caso que foi submetido a análise de ER-Seq, demonstrando sua exatidão para detectar mutações raras e viabilidade para uso na clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A existência de circular de DNA do tumor (ctDNA) foi descoberta há mais de 30 anos atrás, no entanto, a aplicação de análises ctDNA é ainda não é rotina na prática clínica. Interesse na aplicação prática dos métodos de ctDNA aumentou com o desenvolvimento de tecnologias para a detecção de ctDNA e análise. Tumor de monitoramento com ctDNA oferece uma abordagem minimamente invasiva para a avaliação de doença residual microscópica, resposta à terapia e perfis molecular do tumor sob o fundo do tumor ev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Instituto Geneplus – Beijing.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
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