利用下一代测序检测 CtDNA 中的稀有突变
Summary
这篇手稿描述了一种检测低频突变的技术, ctDNA, ER Seq。该方法以其独特的双向误差校正、特殊的背景滤波器和有效的分子获取方式来区分。
Abstract
利用下一代测序 (NGS) 分析循环肿瘤 DNA (ctDNA) 已成为临床肿瘤学发展的重要工具。但是, 该方法在分析血液中微量 ctDNA 的敏感性较低, 具有很高的应用前景。此外, 该方法可能会产生错误的积极和消极的结果, 从这个排序和后续的分析。为了提高 ctDNA 检测在临床中的可行性和可靠性, 本文提出了一种丰富罕见突变的测序方法, 丰富了罕见的突变序列 (ER-Seq)。ER Seq 可以区分出 1 x 107野生类型核苷酸中的单个突变, 这使得它成为检测极低频基因改变的一种很有前途的工具, 因此将对研究疾病 heterogenicity 非常有用。凭借独特的测序适配器的结扎, 这种方法可以有效地恢复 ctDNA 分子, 同时纠正错误双向 (感觉和反义)。我们选择的 1021年 kb 探针丰富了目标区域的测量, 覆盖了12肿瘤中95% 以上与肿瘤相关的驾驶员突变。这种 cost-effective 和通用的方法, 使遗传数据的独特成功的积累。在有效地滤除背景误差后, ER 序列可以精确地检测出稀有的突变。利用案例研究, 我们提出了一个详细的协议演示探针设计, 图书馆建设, 和目标 DNA 捕获方法, 同时也包括数据分析工作流程。执行此方法的过程通常需要1-2 天。
Introduction
下一代测序 (NGS) 是研究基因组奥秘的有力工具, 可以提供大量的信息, 这可能揭示基因的改变。NGS 分析在临床中的应用越来越普遍, 尤其是对个性化医学的研究。然而, NGS 最大的局限性之一是高错误率。虽然它被认为是适合研究遗传突变, 罕见突变的分析很大程度上限制1,2, 特别是当分析从 “液体活检” 获得的 DNA。
循环肿瘤 dna (ctDNA) 是从肿瘤细胞流出的血液中的无细胞 dna (cfDNA)。在大多数情况下, ctDNA 的数量非常低, 这使得它的检测和分析非常具有挑战性。然而, ctDNA 有许多诱人的特点: 它的隔离是微创的, 它可以被发现在肿瘤生长的早期阶段, ctDNA 水平反映治疗效率, 和 ctDNA 包含 DNA 突变发现在主要和转移性病变3,4,5. 因此, 由于 NGS 技术和分析的飞速发展, ctDNA 检测的应用越来越具有吸引力。
ctDNA 检测采用了不同的大规模并行测序方法, 但由于其局限性, 这些方法都没有被接受用于临床常规应用: 灵敏度低、缺乏通用性以及成本较高的6 ,7,8。例如, 基于唯一标识符标记 (UID) 的双工排序, 反复纠正了一致双向中的错误, 纠正了大多数排序错误。但是, 由于该方法的成本高且数据利用率低,9,10, 因此其可行性会丢失。同样, capp-序列及其改进的迭代, capp-ide11,12, 在 cfDNA 检测中具有更大的实用性, 尽管这些方法的准确性和普遍性都需要改进。
为了满足当前对精确 ctDNA 检测和分析的需要, 我们开发了一种新的策略, 丰富了罕见的突变测序 (ER-Seq)。这种方法结合了如下: 独特的测序适配器, 以有效地恢复 ctDNA 分子, 与双向纠错和能力区分单一突变出的和 #62; 1 x 107野生型核苷酸;1021 kb 探头, 它丰富了包括肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、甲状腺癌在内的12肿瘤中95% 以上肿瘤相关突变的靶区测量。宫颈癌, 食管癌, 子宫内膜癌 (表 1);和基线数据库筛选, 使其高效率和易于准确地检测罕见的突变在 ctDNA。
为了建立一个基线数据库, 发现所有的基因突变的 ER 序列从同一类型的样本 (〜1000在开始)。这些真正的突变必须通过其他一些可靠的检测方法和分析来验证。接下来, 总结错误突变的模式, 并将所有的错误突变聚在一起, 建立初始基线数据库。继续增加从随后的测序实验中发现的假突变到这个数据库。因此, 这个基线数据库成为一个动态扩展的数据库, 这大大提高了测序的准确性。
为了促进肿瘤诊断和监测的进展, 我们提出了一种低成本、可行的通用数据获取方法。我们提出的个案研究, 进行了 ER 序列分析, 表明其准确性, 以检测罕见的突变和可行性, 在临床上使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
循环肿瘤 DNA (ctDNA) 的存在在30年前就已被发现, 但 ctDNA 分析的应用在临床实践中仍不常见。随着 ctDNA 检测和分析技术的发展, 对 ctDNA 方法的实际应用兴趣越来越大。肿瘤监测与 ctDNA 提供了微创方法评估的微观残留疾病, 治疗反应, 和肿瘤分子剖面的背景下肿瘤的演变和非均质性13, 14。对分析的灵敏度和特异性的改进将有助于所有这些应用程序<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 Geneplus–Beijing 研究所的支持。
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
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