Détection des Mutations rares dans ADNct à l’aide de prochaine génération séquençage
Summary
Cet article décrit une technique de détection des mutations de basse fréquence dans ADNct, ER-suiv. Cette méthode se distingue par son utilisation unique de correction d’erreur bidirectionnelle, un fond spécial filtre et acquisition moléculaire efficace.
Abstract
L’analyse d’ADN de tumeur (ADNct) à l’aide de la nouvelle génération séquençage (NGS) en circulation est devenu un outil précieux pour le développement de l’oncologie clinique. Toutefois, l’application de cette méthode est difficile en raison de sa faible sensibilité pour analyser la quantité de trace d’ADNct dans le sang. En outre, la méthode peut générer des résultats faussement positifs et négatifs de cette analyse de séquençage et ultérieure. Afin d’améliorer la faisabilité et la fiabilité de la détection d’ADNct dans la clinique, nous présentons une technique qui enrichit les mutations rares pour le séquençage, enrichir la Mutation Rare séquençage (ER-Seq). ER-Seq peut distinguer une seule mutation hors de 1 x 107 nucléotides de type sauvage, qui en fait un outil prometteur pour détecter les altérations génétiques de fréquence extrêmement basse et est donc très utile dans l’étude heterogenicity de la maladie. En vertu de la ligature de l’adaptateur de séquençage unique, cette méthode permet une récupération efficace des molécules ADNct, tandis que dans le même temps corriger des erreurs dans les deux sens (sens et antisens). Notre sélection de sondes 1021 kb enrichit la mesure des régions cibles qui couvrent plus de 95 % des mutations dans les 12 tumeurs pilote axés sur la tumeur. Cette méthode rentable et universelle permet une accumulation particulièrement bien réussie des données génétiques. Après filtrage efficacement une erreur de fond, ER-seq peut détecter précisément des mutations rares. En utilisant une étude de cas, nous présentons un protocole détaillé démontrant la conception de la sonde, la construction de la bibliothèque et méthodes de capture d’ADN cible, tout en incluant aussi le workflow d’analyse de données. Le processus pour réaliser cette méthode en général prend 1 à 2 jours.
Introduction
Le séquençage de prochaine génération (NGS), un outil puissant pour enquêter sur les mystères du génome, peut fournir une grande quantité d’information, qui peut révéler des altérations génétiques. L’application de l’analyse de la NGS dans la clinique est devenue plus fréquente, en particulier pour la médecine personnalisée. L’une des plus grandes limites de NGS, cependant, est un taux élevé d’erreurs. Même si cela est jugé approprié pour étudier les mutations héritées, l’analyse des mutations rares est grandement limitée1,2, en particulier lors de l’analyse ADN obtenue une biopsie « liquide ».
Tumeur en circulation ADN (ADNct) est acellulaire ADN (cfDNA) dans le sang qui est versé de cellules tumorales. Dans la plupart des cas, la quantité d’ADNct est très faible, ce qui rend sa détection et analyse très difficile. Cependant, ADNct possède de nombreuses fonctionnalités attrayantes : son isolement est minimalement invasive, il peut être détecté dans les premiers stades de la croissance tumorale, le niveau d’ADNct reflète l’efficacité thérapeutique et ADNct contient des mutations de l’ADN trouvées dans les lésions primaires et métastatiques 3 , 4 , 5. par conséquent, compte tenu de l’évolution rapide de la technique de la NGS et l’analyse, l’application de détection d’ADNct est devenue plus attrayante.
Séquençage massivement parallèle différentes approches ont été utilisées pour la détection d’ADNct, mais aucune de ces approches ont été acceptés pour utilisation en routine dans les cliniques en raison de leurs limitations : faible sensibilité, manque de polyvalence et un coût relativement élevé6 ,7,8. Par exemple, séquençage duplex, basé sur une étiquette identifiant unique (UID), à plusieurs reprises corrige les erreurs dans le consensus de façon bidirectionnelle, remédier à la plupart des erreurs de séquençage. Cependant, la faisabilité de cette méthode est perdue en raison de son coût élevé et les données à faible utilisation9,10. De même, l’ACPP-Seq et sa version améliorée, CAPP-IDES11,12, ont une plus grande praticité dans la détection de cfDNA, bien que la précision et l’universalité de ces méthodes doivent être améliorés.
Pour répondre au besoin actuel d’ADNct précis de détection et d’analyse, nous avons élaboré une nouvelle stratégie, enrichir les Mutation Rare séquençage (ER-Seq). Cette approche combine le texte suivant : adaptateurs de séquençage unique pour récupérer efficacement les molécules ADNct, avec correction d’erreur bidirectionnelle et la capacité de distinguer une seule mutation de > 1 × 107 nucléotides de sauvage ; sondes de 1021 kb qui enrichissent la mesure des régions cibles qui couvrent plus de 95 % des mutations liées à la tumeur de 12 tumeurs, y compris le cancer du poumon, cancer colorectal, cancer de l’estomac, cancer du sein, cancer du rein, cancer du pancréas, cancer du foie, cancer de la thyroïde, cancer du col utérin, cancer de l’oesophage et carcinome de l’endomètre (tableau 1) ; et base de données de référence de dépistage rendant efficace et facile à détecter précisément des mutations rares dans ADNct.
Pour construire une base de données de base, trouver toutes les mutations de gène par ER-Seq d’un certain nombre du même type d’échantillons (~ 1000 au début). Ces mutations réelles doivent être vérifiées par plusieurs autres méthodes de détection fiable et analyse. Ensuite, résumer le motif des mutations fausses et toutes les mutations fausses pour construire la base de données de base initial de cluster. Continuez à ajouter des mutations fausses trouvées des expériences subséquentes de séquençage à cette base de données. Cette base de données de base devient donc une base de données étendue dynamique, ce qui améliore la précision de séquençage.
Afin de promouvoir le progrès dans le diagnostic de tumeur et le suivi, nous présentons ER-Seq, une méthode abordable et réalisable pour l’acquisition de données universelles. Nous présentons une étude de cas qui a subi une analyse ER-Seq, démontrer l’exactitude des informations pour la détection des mutations rares et faisabilité pour une utilisation en clinique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’existence d’ADN de tumeur (ADNct) en circulation a été découvert plus de 30 ans, mais l’application d’analyses ADNct n’est toujours pas systématique dans la pratique clinique. Intérêt dans l’application pratique des méthodes d’ADNct a augmenté avec le développement de technologies pour la détection d’ADNct et d’analyse. La surveillance des tumeurs avec ADNct offre une approche mini-invasive pour l’évaluation de la maladie résiduelle microscopique, réaction au traitement et les profils m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par l’Institut Geneplus – Beijing.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A., Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
