זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא
Summary
כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.
Abstract
הניתוח של מחזורי גידול דנ א (ctDNA) באמצעות הדור הבא רצפי (הגדרות) הפך להיות כלי רב ערך עבור הפיתוח לאונקולוגיה קלינית. עם זאת, היישום של שיטה זו הוא מאתגר עקב רגישות נמוכה שלה בניתוח הסכום עקבות של ctDNA בדם. יתר על כן, שיטת עשויה ליצור תוצאות false חיוביות ושליליות בניתוח רצף וזו שלאחריה. כדי לשפר את כדאיות והאמינות של זיהוי ctDNA במרפאה, כאן אנו מציגים טכניקה אשר מעשיר מוטציות נדירות עבור רצף, להעשיר נדיר מוטציה רצף (ER-Seq). ER-Seq יכולים להבחין מוטציה יחידה מחוץ נוקלאוטידים פראי-סוג של7 עונה 1 פרק 10, אשר הופכת כלי מבטיח כדי לזהות שינויים גנטיים בתדר נמוך מאוד, וכך יהיה שימושי מאוד בלימוד מחלת heterogenicity. בזכות מצדו של המתאם רצף ייחודי, שיטה זו מאפשרת שחזור יעיל של מולקולות ctDNA, בעוד בלתקן באותו זמן עבור שגיאות ההכפלה (antisense על תבונה). הבחירה שלנו של הגששים 1021 kb מעשיר את המדידה של אזורי היעד למעלה מ- 95% מוטציות הקשורות הגידול הנהג בגידולים 12. שיטה חסכונית ואוניברסלית זו מאפשרת הצטברות מוצלח באופן ייחודי של מידע גנטי. לאחר ביעילות סינון רקע שגיאה, ER-seq בדיוק לזהות מוטציות נדירות. באמצעות חקר מקרה, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט הוכחת בדיקה, בניית ספרייה, ועיצוב יעד ה-DNA לכידת מתודולוגיות, כולל ניתוח נתונים זרימת העבודה. כדי לבצע את שיטה זו בדרך כלל לוקח 1-2 ימים.
Introduction
הדור הבא רצפי (הגדרות), כלי רב עוצמה כדי לחקור את המסתורין של הגנום, יכול לספק כמות גדולה של מידע, אשר עלול לגלות שינויים גנטיים. היישום של המיתרים ניתוח במרפאה הפך נפוץ יותר, במיוחד עבור רפואה אישית. אחת המגבלות הגדול ביותר של המיתרים, אולם, הוא שיעור שגיאה גבוהה. למרות הוא סבור כי מתאים לומד מוטציות תורשתיות, הניתוח של מוטציות נדירות היא מוגבלת מאוד1,2, במיוחד כאשר ניתוח DNA המתקבל “ביופסיה נוזלי”.
במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא ה-DNA ללא תא (cfDNA) הדם ישפך מתאי הגידול. ברוב המקרים, הכמות של ctDNA הוא נמוך ביותר, בו לבצע זיהוי וניתוח שלה מאוד מאתגר. עם זאת, ctDNA יש תכונות אטרקטיביות רבות: הניתוק הוא פולשנית, שניתן יהיה לזהותו בשלבים המוקדמים של הגידול, רמת ctDNA משקף יעילות טיפולית, ctDNA מכיל DNA מוטציות נמצאו בנגעים הראשי והן גרורתי 3 , 4 , 5. לפיכך, לאור ההתפתחות המהירה של המיתרים טכניקה, ניתוח, היישום של זיהוי ctDNA הפך אטרקטיבי יותר.
גישות שונות רצף מקביל בנפט כבר נעזרו ctDNA זיהוי אבל אף אחד גישות אלה התקבלו לשימוש שגרתית במרפאות בשל המגבלות שלהם: נמוך רגישות, חוסר צדדיות, ועלות גבוהה יחסית6 7, ,8. לדוגמה, רצף דופלקס, בהתבסס על תג המזהה הייחודי (UID), שוב ושוב מתקנת שגיאות ההכפלה קונצנזוס, ומתקן שגיאות רצף רוב. אולם, הכדאיות של שיטה זו הוא לאיבוד בשל העלות הגבוהה שלה נתונים נמוכה ניצול9,10. באופן דומה, קאפ-Seq שלה איטראציה משופרת,11,קאפ-אידו12, יש המעשיות גדול בזיהוי cfDNA, למרות הדיוק ואת אוניברסאליות של שיטות אלה זקוקים לשיפור.
כדי לענות על הצורך הנוכחי ctDNA מדויק זיהוי, ניתוח, פיתחנו אסטרטגיה חדשה להעשיר נדיר מוטציה רצף (ER-Seq). גישה זו משלבת את הדברים הבאים: רצף ייחודי מתאמי ביעילות לשחזר מולקולות ctDNA, עם תיקון שגיאות דו-כיוונית ואת היכולת להבחין בין מוטציה יחידה מתוך > נוקלאוטידים פראי-סוג 1 × 107 ; הגששים 1021 kb אשר להעשיר מדידה של אזורי היעד למעלה מ- 95% מוטציות הקשורות גידול של 12 גידולים, כולל סרטן הריאות, סרטן המעי הגס, סרטן הקיבה, סרטן השד, סרטן הכליה, סרטן הלבלב, סרטן הכבד, סרטן בלוטת התריס, סרטן צוואר הרחם, סרטן הוושט, סרטן רירית הרחם (טבלה 1); וסינון מסד נתונים בסיסי שהופך אותו יעיל וקל לזיהוי מוטציות נדירות בדיוק ב- ctDNA.
כדי לבנות מסד נתונים של תוכנית בסיסית, למצוא כל מוטציות מאת ER-Seq ממספר אותו סוג של דגימות (~ 1000 בהתחלה). מוטציות אלה אמיתית יש לאמת על ידי מספר שיטות זיהוי אמין וניתוח אחרים. בשלב הבא, לסכם את התבנית של מוטציות שווא, אשכול כל מוטציות שווא כדי לבנות את מסד הנתונים של התוכנית הבסיסית הראשונית. המשך להוסיף מוטציות שווא למצוא מן הניסויים הבאים רצף מסד נתונים זה. לכן, מסד נתונים בסיסית זה הופך מסד נתונים מורחב דינאמי, אשר משפר באופן משמעותי את רצף דיוק.
לעודד התקדמות הגידול אבחון וניטור, נציג אר-Seq, שיטה בעלות נמוכה האפשריים לצורך רכישת נתונים אוניברסלי. נציג חקר מקרה שגם עברה ניתוח ER-Seq, הממחיש את רמת הדיוק שלה לזיהוי מוטציות נדירות, היתכנות לשימוש במרפאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיומה של מחזורי גידול דנ א (ctDNA) התגלה לפני יותר מ-30 שנה, אולם היישום של ניתוחים ctDNA הוא עדיין אינו שגרתי בפרקטיקה הקלינית. עניין היישום המעשי של שיטות ctDNA גדל עם התפתחות טכנולוגיות ctDNA זיהוי, ניתוח. הגידול ניטור עם ctDNA מציעה גישה מינימלית פולשנית להערכה של מחלה שיורית מיקרוסקופית, בתגובה טיפו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על-ידי המכון Geneplus – בייג’ינג.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A., Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
