Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.
Abstract
Die Analyse der zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) mit Next Generation Sequencing (NGS) ist ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung der klinischen Onkologie geworden. Die Anwendung dieser Methode ist jedoch schwierig wegen seiner niedrigen Empfindlichkeit bei der Analyse der Spur Menge an CtDNA im Blut. Darüber hinaus kann die Methode falsch-positive und negative Ergebnisse aus dieser Sequenzierung und die anschließende Analyse generieren. Um die Machbarkeit und Zuverlässigkeit der CtDNA-Erkennung in der Klinik zu verbessern, stellen wir hier eine Technik, die seltene Mutationen für die Sequenzierung, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq) bereichert. ER-Seq unterscheiden eine einzige Mutation aus 1 x 107 Wildtyp Nukleotide, wodurch es ein viel versprechendes Instrument, extrem niedrigen Frequenzen genetische Veränderungen zu erkennen und somit an einem Studium von Krankheit Heterogenicity sehr nützlich sein wird. Aufgrund der einzigartigen Sequenzierung Adapter Ligation ermöglicht diese Methode eine effiziente Rückgewinnung von CtDNA Molekülen, während zur gleichen Zeit Korrektur für Fehler bidirektional (Sense und Antisense). Unsere Auswahl an 1021 kb Sonden bereichert die Messung der Zielregionen, die decken mehr als 95 % der Tumor-bezogene Fahrer Mutationen in 12 Tumoren. Diese kostengünstige und universelle Methode ermöglicht eine einzigartig erfolgreiche Anhäufung von genetischen Daten. Nach effizient Herausfiltern von Hintergrund-Fehler, kann ER-Seq seltene Mutationen genau erkennen. Mit einer Fallstudie, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zeigen Sonde Design, Bibliotheksbau und Ziel DNA-Aufnahme Methoden, während auch einschließlich des Daten-Analyse-Workflows. Zur Durchführung dieser Methode in der Regel dauert 1-2 Tage.
Introduction
Next Generation Sequencing (NGS), ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, die Geheimnisse des Genoms, bieten eine große Menge an Informationen, die genetische Veränderungen offenbaren kann. Die Anwendung der NGS-Analyse in der Klinik ist immer häufiger, vor allem für die personalisierte Medizin geworden. Eines der größten Einschränkungen der NGS, ist jedoch eine hohe Fehlerquote. Obwohl es für Studium vererbte Mutationen geeignet erachtet wird, ist die Analyse von seltenen Mutationen stark eingeschränkt1,2, vor allem bei der Analyse von DNA aus einer “Flüssigbiopsie” gewonnen.
Tumor im Umlauf ist DNA (CtDNA) zellfreie DNA (Blut) in das Blut, das von Tumorzellen vergossen wird. In den meisten Fällen ist die Menge der CtDNA äußerst gering, die die Erkennung und Analyse sehr anspruchsvoll. CtDNA hat jedoch viele attraktive Features: seine Isolation ist minimal invasiv, kann in den frühen Stadien des Tumorwachstums erkannt werden, die CtDNA Ebene reflektiert therapeutische Effizienz und CtDNA enthält DNA-Mutationen in primären und metastatischen Läsionen gefunden 3 , 4 , 5. daher angesichts die rasante Entwicklung der NGS-Technik und Analyse, die Anwendung der CtDNA-Erkennung ist attraktiver geworden.
Haben verschiedene massiv parallelen Sequenzierung Ansätze zur CtDNA Erkennung verwendet worden, aber keiner dieser Ansätze für den routinemäßigen Einsatz in Kliniken aufgrund ihrer Einschränkungen angenommen worden: niedrige Empfindlichkeit, Mangel an Vielseitigkeit und einen relativ hohen Preis6 ,7,8. Zum Beispiel korrigiert duplex Sequenzierung, basierend auf einem eindeutigen Bezeichner-Tag (UID), immer wieder Fehler in der Konsens bidirektional, die meisten Sequenzierung Fehler beheben. Die Machbarkeit dieser Methode ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und geringe Auslastung9,10verloren. Ebenso haben CAPP-Seq und seine verbesserte Iteration, CAPP-IDES11,12, größeren Praktikabilität im Blut erkennen, obwohl die Genauigkeit und die Universalität dieser Methoden verbessert werden.
Um den aktuellen Bedarf für genaue CtDNA Detektion und Analyse, entwickelten wir eine neue Strategie, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq). Dieser Ansatz verbindet die folgenden: einzigartige Sequenzierung Adapter effizient wiederherstellen CtDNA Moleküle mit bidirektionalen Fehlerkorrektur und die Fähigkeit, eine einzige Mutation von unterscheiden > 1 × 107 Wildtyp Nukleotide; 1021 kb-Sonden, die Messung der Zielregionen zu bereichern, die decken mehr als 95 % der Tumor im Zusammenhang mit Mutationen von 12 Tumoren, einschließlich Lungenkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Schilddrüsen-Krebs, Gebärmutterhalskrebs, Speiseröhrenkrebs und Endometrium-Karzinom (Tabelle 1); und Grunddatenbank screening machen, effizient und einfach zu seltene Mutationen im CtDNA genau zu erkennen.
Um eine Baseline-Datenbank zu erstellen, finden Sie alle Gen-Mutationen durch ER-Seq aus einer Reihe von der gleichen Art von Proben (~ 1000 am Anfang). Diese echte Mutationen ist durch mehrere andere zuverlässige Nachweismethoden und Analyse nachzuweisen. Als nächstes zusammenfassen, das Muster der falschen Mutationen und cluster-die falsche Mutationen um die erste Grundlinie-Datenbank zu erstellen. Weitere falsche Mutationen gefunden von nachfolgenden Sequenzierung Experimente zu dieser Datenbank hinzufügen. Daher wird diese Grunddatenbank dynamische erweiterte Datenbank, die Sequenzierung Genauigkeit deutlich verbessert.
Um Fortschritte bei der Tumor-Diagnose und Überwachung zu fördern, präsentieren wir ER-Seq, eine kostengünstige und praktikable Methode für den Erwerb von allgemeinen Daten. Wir präsentieren eine Fallstudie, die ER-Seq Analyse unterzog sich demonstriert seine Genauigkeit zum Nachweis von seltenen Mutationen und Machbarkeit für den Einsatz in der Klinik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Existenz zirkulierender Tumor-DNA (CtDNA) wurde vor mehr als 30 Jahren entdeckt, aber die Anwendung von CtDNA Analysen noch nicht routinemäßig in der klinischen Praxis ist. Interesse an der praktischen Anwendung von CtDNA Methoden hat mit der Entwicklung von Technologien zur CtDNA Erkennung und Analyse erhöht. Tumor-Überwachung mit CtDNA bietet einen minimal-invasive Ansatz für die Bewertung der mikroskopischen Resterkrankung, Reaktion auf Therapie und molekulare Tumor-Profile unter dem Hintergrund der Tumor Evo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von Geneplus – Beijing Institute unterstützt.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
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