Развитие человека доклинических модели Osteoclastogenesis от периферической крови моноциты совместно культивируемых с линии клеток рака молочной железы
Summary
Этот протокол описывает развитие в vitro человека доклинических модели osteoclastogenesis от периферической крови моноциты, культивируемых с линии клеток рака молочной железы для имитации взаимодействия клеток остеокластов рака. Модель может использоваться для нашего понимания формирования метастазы костей и улучшать терапевтические возможности.
Abstract
Перекрестных помех между опухолевые клетки и клетки кость в кость микроокружения имеет решающее значение для понимания механизма формирования метастазов в кости. Мы разработали в vitro полностью человека доклинических модель совместного культуры клеток рака молочной железы и моноцитов, происходят дифференциация направлении остеокластов. Мы оптимизировали модель osteoclastogenesis, начиная от образца периферической крови, собранные из здоровых доноров. Мононуклеаров периферической крови (получения) были впервые разделенных плотность градиентного центрифугирования, семенами на высокой плотности и индуцированных дифференцировать путем добавления двух факторов роста (GFs): рецептор активатор ядерный фактор κB лиганда (RANKL) и макрофагов колониестимулирующий фактор (MCSF). Клетки были оставил в культуре на 14 дней и затем фиксированной и проанализированы по течению анализа. В кости литического метастазы одним из эффектов прибытия клеток рака в кости — индукция osteoclastogenesis. Мы таким образом под сомнение нашу модель с совместного культур клеток рака молочной железы для изучения дифференциации власть раковых клеток по СГФ. Простой способ изучения раковых клеток остеокластов взаимодействия является выполнение косвенные совместно культуры, основанной на использовании кондиционером среднего собраны из культур клеток рака молочной железы и смешивают с свежими среднего. Затем эта смесь используется для побудить дифференциации остеокластов. Мы также оптимизировали метод прямого совместного культуры, в которой рак клеток и претерпевает дифференцировки моноцитов среднего и обмена и секретируемые факторов. Это значительное улучшение по сравнению оригинальный метод косвенного Сопредседатель культуры как исследователи могут наблюдать взаимное взаимодействие типов двух клеток и вниз по течению анализ для раковых клеток и остеокласты. Этот метод позволяет нам изучить влияние препаратов на метастатическим кости микроокружения и семян клеточных линий, помимо тех, которые получены от рака молочной железы. Модель может также использоваться для изучения других заболеваний, таких как остеопороз или других условий, кости.
Introduction
Кости является общий сайт метастазов для различных типов первичных опухолей, таких как рак простаты, легких и молочной железы, с 20-25% пациентов развивающихся костных метастазов в течение болезни1,2,3. В частности 70% больных раком молочной железы несут доказательства костных метастазов в смерти4. Опухоли и стромальных клеток взаимодействия имеет важное значение для прогрессии рака в первичного рака и вторичные поражения. В кости микроокружения литического костных метастазов от рака молочной железы зависит создание патологический порочный круг, происходящих между раковые клетки, костные клетки и микроокружения кости. Раковые клетки нарушить баланс кости, увеличение костной резорбции5,6,7.
В нормальных и патологических условиях остеокласты являются клетки, ответственные за костной резорбции, тогда как остеобластов, в сдаче новой матрицы, отвечают за формирование новой кости8. Активность остеокластов регулируется остеобластов через выражение RANKL, которое связывается с рецептором ранга на поверхности предварительно остеокластов, вызывая предварительно остеокластов фьюжн, необходимый процесс для дифференциации в зрелых остеокластов. Индукции osteoclastogenesis увеличивает костную резорбцию. Большое количество в vivo исследований значительно улучшили наше понимание костных метастазов формирования9,10,11. Груди раковые клетки из первичной опухоли и в кости микроокружения возмущают кости гомеостаза, содействия osteoclastogenesis и костной резорбции8. В этом сценарии все молекулярного взаимодействия, которые происходят между раковые клетки и остеокласты имеют решающее значение. Как уже упоминалось механизм формирования метастазы костей выяснен в в естественных условиях моделей мышей. Однако помимо необходимости для утверждения всех в естественных условиях экспериментов на животных Комитетом по этике, существует ряд других недостатков для выполнения в естественных условиях экспериментов, включая высокие расходы и трудоемких методов. Несколько авторов объединили доклинических в vivo и in vitro модели osteoclastogenesis с помощью мышиных строки предварительно остеокластов, под названием RAW246.79,10,11. Недостатки этой модели проистекают из того факта, что клетки уже привержены становится предварительно остеокластов и не человеческого происхождения. По этим причинам трансляционного исследования значительно выиграют от наличия в vitro полностью человека доклинических моделей для изучения взаимодействия клеток рака кости.
Мы оптимизировали метод osteoclastogenesis в vitro начиная с периферической крови человека образцы12,13. Остеокласты вытекают из моноцитов, которые присутствуют, хотя и в малой степени, в периферической крови. Сначала мононуклеаров отделены от гранулоцитов в цельной крови и эритроцитах Ficoll градиент плотности; Затем они выбраны благодаря их способности соблюдать Пластиковые субстраты, в отличие от лимфоцитов. После посева, клетки культивируемых на 14 дней. GFs, моноциты необходимо дифференцировать сначала в макрофагов и затем остеокласты14,15MCSF и RANKL. MCSF необходима для всей продолжительности assay, тогда как RANKL используется для стимулирования процесса дифференцировки в поздних стадиях osteoclastogenesis. В ранней фазе дифференциации MCSF помогает моноциты размножаться и выжить14,15. В ходе второй части osteoclastogenesis клетки сливаются и зрелые как остеокласты, показывая характерное распределение актина F в кольца и выражая конкретных маркеры например тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка) и кальцитонина рецептор (CTR) 14 , 15. наш метод состоит из добавления Моноцит культуры для первых 7 дней эксперимента и сочетание MCSF и RANKL MCSF от 7 до 14 дней. В конце эксперимента osteoclastogenesis анализируется путем подсчета дифференцированных клеток, как описано ниже.
Моноцит культур, индуцированной дифференцировать, GFs основой нашей доклинических модели. Мы оптимизировали систему совместного культуры без GFs лучше понять власть osteoclastogenic клеток рака молочной железы. Мы впервые разработал модель косвенного Сопредседатель культур, добавив средства (80% α-минимальным необходимым среднего (α-MEM) и 20% кондиционером среднего собранные от культуры клеток рака молочной железы что проходили около 90% притока к клеткам дифференциация12 . Кондиционерами среднего (не собираются в условиях лишений сыворотки) было собрано после 24 часов и смешивают с свежей среды в пропорции 1:4. Кондиционерами среднего индуцированной значительные остеокластов дифференциации в отношении отрицательного контроля. Однако как информация о взаимных взаимодействие между раковые клетки и клетки костной теряется при использовании косвенных Сопредседатель культур, мы улучшили нашу систему путем проведения прямого сотрудничества культур. Мы посеян раковые клетки в 0,4 мкм вставляет и помещали их в скважинах, где были покрытием мононуклеарных клеток. С помощью этого метода, клетки той же среде и обмена и секретируемые белки. Таким образом мы создали модель полностью человека доклинические osteoclastogenesis индуцированных раковых клеток13.
Эта система является чрезвычайно универсальны и могут использоваться для различных научно-исследовательских целей, например, в фармакологических исследований, изучение роли наркотиков в костных метастазов. Наша модель позволяет изучить эффективность и механизмы действия кости целевой терапии и/или противоопухолевых препаратов в кости микроокружения присутствии раковых клеток13. Проектирование экспериментов с правильного управления, т.е., раковые клетки и остеокласты, культивированный индивидуально, делает его легче понять влияние совместного культуры на активность препарата. Этот подход становится еще более интересным, когда препарат изучаются цели оба раковых клеток и остеокласты, например, эверолимус16. Эта модель также может использоваться для выявления новых путей взаимодействия между раковые клетки и клетки костной ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Доклинические в vitro модели изучения механизмов перекрестных помех между раковые клетки и клетки костей необходимы для выявления механизмов костных метастазов, который может использоваться для создания новых терапевтических стратегий. Мы разработали модель полностью человека <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Ибинь Кан для обеспечения линии клеток SCP2 и Кристиано Verna для редакционной помощи.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it’s all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
