Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

Summary

Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma em vitro humana pré-clínicos modelo de osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico cultivados com linhas de células de câncer de mama para simular a interação de osteoclasto-célula de câncer. O modelo pode ser usado para promover nossa compreensão da formação de metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.

Abstract

O crosstalk entre células tumorais e células ósseas no microambiente do osso é crucial para a compreensão do mecanismo de formação de metástase óssea. Desenvolvemos um em vitro totalmente pré-clínicos modelo humano de um co-cultura de células de câncer de mama e monócitos, passando por diferenciação no sentido de osteoclastos. Nós aperfeiçoamos um modelo de osteoclastogenesis a partir de uma amostra de sangue periférico coletada de doadores saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) primeiro foram separadas por centrifugação gradiente de densidade, semeadas em uma densidade elevada e induzidas a diferenciar-se pela adição de dois fatores de crescimento (GFs): ativador do receptor do ligante fator nuclear-κB (RANKL) e macrófagos fator colônia-estimulando (MCSF). As células foram deixadas na cultura durante 14 dias e então fixo e analisadas pela análise a jusante. Em metástases ósseas osteolíticas, um dos efeitos da chegada de células de câncer no osso é a indução de osteoclastogenesis. Assim, desafiamos nosso modelo com colegas de culturas de células de câncer de mama para estudar o poder de diferenciação de células de câncer com relação a GFs. Uma maneira simples de estudar a interação de osteoclasto-célula de câncer é realizar culturas co indirectas, baseadas na utilização do meio condicionado colhidos em culturas de células de câncer de mama e misturado com meio fresco. Esta mistura é usada para induzir a diferenciação do osteoclast. Nós também Aperfeiçoamos um método de co-cultura direto no qual câncer células e passando por diferenciação de monócitos compartilham o meio em trocam de fatores secretados. Isto é uma melhoria significativa sobre o método indireto co-cultura original como pesquisadores podem observar as interações recíprocas a tipos de duas células e realizar análises a jusante para as células cancerosas e osteoclastos. Este método permite-nos estudar o efeito das drogas sobre o microambiente metástase óssea e às linhas de célula semente que não sejam aqueles derivados de câncer de mama. O modelo também pode ser usado para estudar outras doenças como a osteoporose ou outras condições de osso.

Introduction

Osso é um local comum de metástases para diferentes tipos de tumores primários, como o câncer de próstata, pulmão e mama, com 20-25% dos pacientes desenvolvendo metástases ósseas durante o curso da doença.^1,2,3. Em particular, 70% dos pacientes de câncer de mama carregar evidências de metástases ósseas em morte⁴. Tumor e células estromais interação é essencial para a progressão do câncer em câncer primário e lesões secundárias. No microambiente do osso, metástases ósseas osteolíticas de câncer de mama dependem do estabelecimento de um ciclo vicioso patológico ocorrendo entre as células cancerosas, células ósseas e o microambiente do osso. As células cancerosas perturbam o equilíbrio do osso, aumentando a reabsorção de osso^5,6,7.

Em condições normais e patológicas, osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção óssea, enquanto que os osteoblastos, em depositar a nova matriz, são responsáveis pela formação de osso novo⁸. Atividade do osteoclasto é regulada por osteoblastos através da expressão de RANKL, que liga a seu receptor RANK na superfície de pre-osteoclasto, induzindo pre-osteoclast fusão, um processo necessário para diferenciação em osteoclastos maduros. A indução de osteoclastogenesis aumenta a reabsorção óssea. Um grande número de estudos em vivo melhoraram significativamente a nossa compreensão da metástase óssea formação^9,10,de¹¹. Células de câncer de mama do tumor primário e o microambiente ósseo perturbam a homeostase do osso, promovendo osteoclastogenesis e osso reabsorção⁸. Neste cenário, todas as interações moleculares que ocorrem entre as células cancerosas e osteoclastos são de importância crucial. Como já mencionado, o mecanismo de formação de metástase óssea já foi elucidado em modelos de ratos na vivo . No entanto, para além da necessidade de aprovação de todos na vivo as experiências com animais pelo Comitê de ética, existem vários outros inconvenientes para realizar experimentos na vivo incluindo altos custos e demorados métodos. Vários autores têm combinado pré-clínicos modelos in vivo e in vitro de osteoclastogenesis usando uma linha de murino de pre-osteoclastos chamado RAW246.7^9,10,11. As desvantagens deste modelo derivam do fato de que as células já estão empenhadas em tornar-se pre-osteoclastos e não são de origem humana. Por estas razões, pesquisa translacional poderia beneficiar grandemente a disponibilidade em vitro plenamente humano modelos pré-clínicos para estudar interações de célula de câncer de osso.

Nós aperfeiçoamos um método de osteoclastogenesis em vitro a partir de amostras de sangue periférico humano^12,13. Os osteoclastos derivam de monócitos, que estão presentes, embora em pequeno grau, em amostras de sangue periférico. Células mononucleares são primeiro separou os eritrócitos e granulócitos presentes em sangue total por gradiente de densidade Ficoll; Eles são então selecionados graças a sua capacidade de aderir ao substrato plástico, ao contrário dos linfócitos. Após a semeadura, as células são cultivadas por 14 dias. MCSF e RANKL são o GFs exigido por monócitos para diferenciar primeiro em macrófagos e depois em osteoclastos^14,15. MCSF é necessária para toda a duração do ensaio, enquanto RANKL é usado para induzir o processo de diferenciação em estágios finais de osteoclastogenesis. Na fase inicial de diferenciação, MCSF ajuda monócitos proliferam e sobreviver^14,15. Durante a segunda parte do osteoclastogenesis, as células se fundem e amadurecem como osteoclastos, mostrando a distribuição característica de actina F em anéis e expressando marcadores específicos tais como a fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) e receptor de calcitonina (CTR) ^{14 , 15}. nosso método consiste em Adicionar MCSF para a cultura de monócitos para os primeiros 7 dias do experimento e uma combinação de MCSF e RANKL dos dias 7 a 14. No final do experimento, osteoclastogenesis é analisado pela contagem de células diferenciadas, conforme detalhado abaixo.

As culturas de monócitos induzidas para diferenciar pelo GFs formam a base do nosso modelo pré-clínicos. Nós aperfeiçoamos um sistema co-cultura sem GFs para entender melhor o poder de osteoclastogenic de células de câncer de mama. Primeiro desenvolvemos um modelo de culturas co indiretos adicionando uma média (80% α-meio essencial mínimo (α-MEM) e 20% condicionado médio coletado de uma cultura de células de câncer de mama que foram confluente cerca de 90% de células em fase de diferenciação¹² . O meio condicionado (não recolhido em condições de privação de soro) foi coletado após 24 horas e misturado com meio fresco em uma proporção de 1:4. O meio condicionado induzido diferenciação osteoclast significativa em relação ao controle negativo. No entanto, como as informações sobre a interação recíproca entre as células cancerosas e células ósseas são perdidas quando utilizar culturas co indiretas, melhoramos nosso sistema efectuando culturas co diretas. Temos semeado células cancerosas em 0,4 µM insere e colocou-os em poços onde as células mononucleares foram banhadas. Usando esse método, as células compartilham o mesmo meio e trocam proteínas secretadas. Assim, criamos um modelo totalmente humano pré-clínicos de osteoclastogenesis induzida por câncer células¹³.

Este sistema é extremamente versátil e pode ser usado para fins de investigação diferentes, por exemplo, em estudos farmacológicos, investigando o papel das drogas na metástase óssea. Nosso modelo torna possível estudar a eficácia e os mecanismos de ação das terapias de osso-alvo e/ou drogas antitumorais no microambiente de osso na presença de células de câncer¹³. Projetando os experimentos com os controles corretos, ou seja, as células cancerosas e osteoclastos cultivados individualmente, torna mais fácil compreender o impacto da cultura co na atividade de drogas. Esta abordagem se torna ainda mais interessante quando ambos câncer células e osteoclastos, por exemplo, everolimus¹⁶destina-se a droga em estudo. Este modelo também pode ser usado para identificar novos caminhos de interação entre as células cancerosas e células ósseas.

Protocol

osteoclastos humanos foram diferenciados de PBMC de doadores saudáveis que deu consentimento escrito para participar no estudo. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local, em conformidade com os padrões éticos estabelecidos na declaração de Helsinque 1964. 1. diferenciação osteoclast Nota: coletar sangue periférico ou casacos de buffy de doadores humanos saudáveis em EDTA. Não use a menos de 20 mL de sangue periférico. Casacos de Buf…

Representative Results

Um método foi otimizado para diferenciar facilmente osteoclastos dos monócitos do sangue periférico humano. A cultura de monócitos foi cultivada com células cancerosas, confirmando (conforme descrito na literatura18) que as células cancerosas são capazes de sustentar osteoclastogenesis em metástases ósseas. Osteoclastos, diferenciadas das células cancerosas e GFs são mostrados na Figura 1. Uma célula tipo osteoclasto é uma…

Discussion

Modelos pré-clínicos em vitro estudando os mecanismos de interferência entre células cancerosas e células ósseas são necessários para identificar mecanismos de metástase óssea que pode ser usado para criar novas estratégias terapêuticas. Desenvolvemos um modelo totalmente humano em vitro de osteoclastogenesis de sangue periférico humano (Figura 3). Durante a otimização da metodologia, um número de pontos críticos foram identificado e resolvido. O primeiro d…

Materials

αMEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamine	Life-technologies	ECB3000D
Fetal bovine serum	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	Storage indications must be respected
hRANKL	Peprotech	310-01	Storage indications must be respected
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma Aldrich	387 A
Lymphocyte separation media	Biowest	L0560-100
Red Blood cell lysing buffer	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 cell line	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size