乳腺癌细胞系外周血单核细胞破的人前临床模型的建立
Summary
该协议描述了一个体外的发展, 从外周血单核细胞中培养的乳癌细胞系破人前模型, 模拟癌细胞-破骨细胞的相互作用。该模型可用于进一步了解骨转移形成和改善治疗方案。
Abstract
骨微环境中肿瘤细胞与骨细胞之间的串扰是了解骨转移形成机制的关键。我们开发了一个体外完全人前模型的乳腺癌细胞共培养和单核化的分化为破骨病。我们优化了一个模型的破开始从一个样本的外周血从健康的捐助者收集。外周血单个核细胞 (PBMCs) 首先通过密度梯度离心分离, 在高密度下播种, 并通过增加两种生长因子诱导分化 (GFs): 核因子-nf-配体 (RANKL) 和巨噬细胞的受体激活剂集激发因子 (MCSF). 细胞被留在培养14天, 然后通过下游分析固定和分析。在骨骨转移, 肿瘤细胞到达骨的影响之一是诱导破。因此, 我们挑战我们的模型与 co-cultures 乳腺癌细胞, 以研究的分化能力的癌细胞与 GFs 有关。一个直接的方法研究癌细胞-破骨细胞相互作用是执行间接 co-cultures 的基础上, 利用条件培养基收集的乳腺癌细胞培养和混合新鲜培养基。这种混合物用于诱导破骨细胞分化。我们还优化了直接共培养的方法, 其中癌细胞和单核细胞的分化分享媒介和交换分泌的因素。这是一个显著的改进, 在原来的间接共培养方法, 因为研究人员可以观察两个细胞类型的相互作用, 并执行下游分析的癌细胞和破骨细胞。这种方法使我们能够研究药物对转移性骨微环境的影响, 以及除乳腺癌以外的种子细胞株。该模型还可用于研究其他疾病, 如骨质疏松症或其他骨骼条件。
Introduction
骨是一种常见的转移为不同类型的原发性肿瘤, 如前列腺癌, 肺癌和乳腺癌, 20-25% 的病人发展骨转移在疾病过程中1,2,3。特别是, 70% 的乳腺癌患者携带骨转移的证据在死亡4。肿瘤和基质细胞的相互作用是癌症进展的主要癌症和继发性病变。在骨骼微环境中, 乳腺癌的骨骨转移依赖于肿瘤细胞、骨细胞和骨微环境之间的病理恶性循环的建立。肿瘤细胞破坏骨平衡, 增加骨吸收5,6,7。
在正常和病理条件下, 破骨细胞是负责骨质吸收的单元, 而骨细胞, 在沉积新的基质, 负责新骨形成8。破骨细胞的活性通过 RANKL 的表达来调节, 这与其受体在 pre-osteoclast 表面的排列有关, 诱导 pre-osteoclast 融合, 这是分化为成熟破骨的必要过程。诱导破增加骨吸收。大量的体内研究显著提高了我们对骨转移形成的认识9,10,11。乳腺癌细胞从原发肿瘤和骨微环境扰乱骨内稳态, 促进破和骨吸收8。在这种情况下, 所有的分子相互作用发生在癌细胞和破骨细胞之间是至关重要的。正如已经提到的, 骨转移形成的机制已在体内小鼠模型中阐明。然而, 除了需要批准的所有在体内动物实验的伦理委员会, 有几个其他缺点, 以执行在体内实验, 包括高成本和耗时的方法。一些作者将临床前的在体内和体外模型的破使用小鼠线的 pre-osteoclasts 称为 RAW246.79,10,11。这个模型的缺点是由于细胞已经致力于成为 pre-osteoclasts, 而不是人类的起源。由于这些原因, 转化研究可以大大受益于体外充分的人前临床模型研究骨肿瘤细胞的相互作用。
我们优化了破体外的方法, 从人外周血样本开始,12,13。破骨细胞来源于单核细胞, 虽然在很小程度上存在于外周血标本中。通过聚密度梯度将单个核细胞从红细胞和粒中分离出来;他们然后选择, 由于他们的能力坚持塑料基板, 不同于淋巴细胞。播种后, 细胞培养14天。MCSF 和 RANKL 是单核细胞所需的 GFs, 以先分化成巨噬, 然后再进入破骨14,15。MCSF 是需要的整个期间的化验, 而 RANKL 是用来诱导分化过程的后期阶段的破。在分化的早期阶段, MCSF 帮助单核细胞增殖并存活14,15。在破的第二部分, 细胞融合并成熟为破骨, 显示了肌动蛋白 F 在环中的特征分布, 并表达了抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 和降钙素受体等特异标记物中心)14,15. 我们的方法包括在实验的前7天将 MCSF 添加到单核细胞培养中, 并结合 MCSF 和 RANKL 从7天到14。在实验结束时, 破通过计数的分化细胞进行分析, 详见下文。
由 GFs 诱导分化的单核细胞培养是我们临床前模型的基础。我们优化了一个没有 GFs 的共培养系统, 以更好地了解乳腺癌细胞的 osteoclastogenic 能力。我们首先开发了一个间接 co-cultures 的模型, 添加了一个培养基 (80% α-最低基本培养基 (α-记忆) 和20% 条件培养基, 从培养的乳腺癌细胞, 约90% 融合到细胞进行分化12.条件培养基 (未在血清剥夺状态下收集) 在24小时后收集, 并与新鲜培养基混合, 比例为1:4。条件培养基诱导的破骨细胞分化与阴性对照有关。然而, 当使用间接 co-cultures 时, 由于癌细胞与骨细胞相互作用的信息丢失, 我们通过直接 co-cultures 来改善我们的系统。我们在0.4 µM 的插入物中植入癌细胞, 并将它们放置在单核细胞被电镀的井中。使用这种方法, 细胞共享相同的培养基和交换分泌的蛋白质。因此, 我们创造了一个完整的人类临床前模型的破诱导肿瘤细胞13。
这个系统是非常多才多艺的, 可以用于不同的研究目的,例如, 在药理研究中的作用, 调查药物在骨转移。我们的模型使得有可能研究骨靶向治疗和/或抗肿瘤药物在肿瘤细胞存在的作用和机制13。用正确的控制方法设计实验,即, 单独培养的癌细胞和破骨细胞, 使人们更容易理解共育对药物活动的影响。当研究的药物靶向癌细胞和破骨细胞时, 这种方法变得更加有趣,例如, 司16。这个模型也可以用来识别癌细胞和骨细胞之间相互作用的新途径。
Protocol
Representative Results
Discussion
临床前体外模型研究肿瘤细胞与骨细胞之间的串扰机制, 需要确定骨转移的机制, 以建立新的治疗策略。我们开发了一个完全人的体外模型的人外周血破 (图 3)。在方法优化过程中, 确定和解决了一些关键点。第一个是关于单个核细胞数量的种子。通过显微镜计数获得的细胞数量只是一个粗略的定量, 因为它很难区分淋巴细胞和单核细胞, 后者是破实验中的靶体细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢宜宾康提供 SCP2 细胞系和罗纳尔多佛娜的编辑协助。
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
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