Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno
Summary
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l’interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.
Abstract
Il crosstalk tra cellule tumorali e cellule di osso nel microambiente osseo è fondamentale per la comprensione del meccanismo di formazione di metastasi dell’osso. Abbiamo sviluppato un in vitro pienamente umano modello preclinico di un co-coltura delle cellule di cancro al seno e monociti in fase di differenziazione verso gli osteoclasti. Abbiamo ottimizzato un modello di osteoclastogenesi a partire da un campione di sangue periferico raccolto da donatori sani. Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) sono state separate da centrifugazione in gradiente di densità, seminate ad una densità elevata e indotte a differenziarsi con l’aggiunta di due fattori di crescita (GFs): attivatore del ricevitore di fattore-κB nucleare ligando (RANKL) e del macrofago fattore distimolazione (MCSF). Le cellule erano lasciate in coltura per 14 giorni e quindi fisso e analizzate da analisi a valle. In metastasi osteolitiche, uno degli effetti dell’arrivo di cellule di cancro in osso è l’induzione di osteoclastogenesi. Così abbiamo sfidato il nostro modello con co-colture di cellule di cancro al seno per studiare il potere di differenziazione delle cellule tumorali rispetto a GFs. Un modo semplice per studiare l’interazione delle cellule osteoclasti di cancro è quello di eseguire indirette co-colture basate sull’uso del medium condizionato raccolti da colture di cellule di cancro al seno e mescolato con mezzo fresco. Questa miscela viene quindi utilizzata per indurre la differenziazione degli osteoclasti. Abbiamo inoltre ottimizzato un metodo di co-coltura diretta in cui il cancro cellule e monociti in fase di differenziazione il mezzo di condividere e scambiano fattori secreti. Questo è un miglioramento significativo sopra l’originale metodo di co-culture indiretta come i ricercatori possono osservare le interazioni reciproche dei due tipi cellulari ed eseguire analisi a valle per sia le cellule tumorali e gli osteoclasti. Questo metodo permette di studiare l’effetto delle droghe sul microambiente osseo metastatico e di linee cellulari di seme diverso da quelli derivati da cancro al seno. Il modello è utilizzabile anche per lo studio di altre malattie come l’osteoporosi o altre condizioni di osso.
Introduction
L’osso è un comune sito di metastasi per diversi tipi di tumori primari come il cancro della prostata, del polmone e del seno, con 20-25% dei pazienti che sviluppano metastasi ossee durante il corso della malattia1,2,3. In particolare, il 70% dei pazienti di cancro al seno trasportare prova della metastasi dell’osso alla morte4. Tumore e cellule stromali interazione è essenziale per la progressione del cancro cancro primario sia lesioni secondarie. Nel microambiente osseo, metastasi osteolitiche dell’osso da cancro al seno dipendono l’istituzione di un circolo vizioso patologico che si verificano tra le cellule tumorali, le cellule ossee e il microambiente osseo. Le cellule tumorali interrompono l’equilibrio dell’osso, aumentando il riassorbimento di osso5,6,7.
In condizioni normali e patologiche, gli osteoclasti sono le cellule responsabili del riassorbimento dell’osso, mentre gli osteoblasti, nel depositare nuova matrice, sono responsabili per la formazione di osso nuovo8. Attività degli osteoclasti è regolata da osteoblasti attraverso l’espressione di RANKL, che lega al suo recettore RANK sulla superficie degli pre-osteoclasti, inducendo degli pre-osteoclasti fusione, un processo necessario per la differenziazione in osteoclasti maturi. L’induzione di osteoclastogenesi aumenta il riassorbimento dell’osso. Un gran numero di studi in vivo hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione di osso metastasi formazione9,10,11. Cellule di cancro al seno dal tumore primario e nel microambiente osseo perturbano l’omeostasi dell’osso, promuovendo osteoclastogenesi e dell’osso di riassorbimento8. In questo scenario, tutte le interazioni molecolari che si verificano tra cellule tumorali e gli osteoclasti sono di importanza cruciale. Come già accennato, il meccanismo di formazione di metastasi dell’osso è stato delucidato in modelli di topi in vivo . Tuttavia, oltre alla necessità per l’approvazione di tutti in vivo gli esperimenti sugli animali dal comitato etico, ci sono diversi altri inconvenienti a in vivo esperimenti, compresi i metodi che richiede tempo e costi elevati. Parecchi autori hanno combinato modelli preclinici in vivo e in vitro di osteoclastogenesi utilizzando una linea murina degli pre-osteoclasti chiamato RAW246.79,10,11. Gli svantaggi di questo modello derivano dal fatto che le cellule sono già impegnate a diventare pre- osteoclasti e non sono di origine umana. Per questi motivi, ricerca traslazionale potrebbe beneficiare grandemente la disponibilità di in vitro pienamente umano modelli preclinici per studiare le interazioni delle cellule di osso cancro.
Abbiamo ottimizzato un metodo di osteoclastogenesi in vitro a partire da sangue periferico umano campioni12,13. Gli osteoclasti derivano da monociti, che sono presenti, seppur in misura limitata, in campioni di sangue periferico. Cellule mononucleari in primo luogo sono separate dal eritrociti e granulociti presenti nel sangue intero mediante gradiente di densità di Ficoll; vengono quindi selezionati grazie alla loro capacità di aderire al substrato di plastica, a differenza dei linfociti. Dopo la semina, le cellule sono coltivate per 14 giorni. Il GFs richiesto dai monociti per differenziare in primo luogo in macrofagi e poi in osteoclasti14,15MCSF e RANKL. MCSF è necessaria per tutta la durata del test, mentre RANKL viene utilizzato per indurre il processo di differenziazione nelle fasi tardive di osteoclastogenesi. Nella fase in anticipo di differenziazione, MCSF aiuta i monociti proliferare e sopravvivere14,15. Durante la seconda parte di osteoclastogenesi, le cellule si fondono insieme e maturano come gli osteoclasti, mostrando la distribuzione caratteristica di actina F in anelli e che esprimono gli indicatori specifici quali la fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) e del recettore della calcitonina (CTR) 14 , 15. il nostro metodo consiste nell’aggiungere MCSF alla cultura del monocito per i primi 7 giorni dell’esperimento e una combinazione di MCSF e RANKL da 7 a 14 giorni. Alla fine dell’esperimento, osteoclastogenesis è analizzato contando le cellule differenziate, come dettagliato di seguito.
Le culture del monocito indotte a differenziarsi da GFs costituiscono la base del nostro modello preclinico. Abbiamo ottimizzato un sistema di co-coltura senza GFs per meglio comprendere il potere di osteoclastogenico delle cellule di cancro al seno. Abbiamo in primo luogo sviluppato un modello di co-culture indirette aggiungendo un mezzo (80% α-terreno minimo essenziale (α-MEM) e 20% condizionato media raccolti da una coltura di cellule di cancro al seno che erano circa 90% confluenti di cellule in fase di differenziazione12 . Il medium condizionato (non raccolto in condizioni di deprivazione di siero) è stato raccolto dopo 24 ore e mescolato con mezzo fresco in proporzione di 1:4. Il medium condizionato ha indotto la differenziazione degli osteoclasti significativo rispetto al controllo negativo. Tuttavia, come le informazioni sulla reciproca interazione tra cellule tumorali e cellule ossee sono perse quando si utilizza co-culture indirette, abbiamo migliorato il nostro sistema di svolgimento dirette co-colture. Abbiamo seminato le cellule tumorali in 0,4 µM inserti e li ha posti in pozzetti in cui sono state placcate cellule mononucleari. Utilizzando questo metodo, le cellule condividono lo stesso mezzo e scambiano di proteine secrete. Abbiamo così creato un modello preclinico pienamente umano di osteoclastogenesi indotta da cancro cellule13.
Questo sistema è estremamente versatile e può essere utilizzato per scopi di ricerca diversi, ad esempio, in studi farmacologici, indagando il ruolo dei farmaci in metastasi dell’osso. Il nostro modello permette di studiare l’efficacia e i meccanismi d’azione delle terapie mirate dell’osso e/o farmaci antitumorali nel microambiente osseo in presenza di cancro cellule13. Progettazione degli esperimenti con i controlli corretti, cioè, le cellule tumorali e gli osteoclasti coltivati singolarmente, lo rende più facile capire l’impatto della co-cultura su attività della droga. Questo approccio diventa ancora più interessante quando entrambi cancro cellule e osteoclasti, per esempio, everolimus16è destinato il farmaco oggetto di studio. Questo modello è utilizzabile anche per identificare nuove vie di interazione tra cellule tumorali e cellule ossee.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelli preclinici in vitro studiando i meccanismi di diafonia tra cellule tumorali e cellule ossee sono necessari per identificare i meccanismi della metastasi dell’osso che può essere utilizzato per creare nuove strategie terapeutiche. Abbiamo sviluppato un modello pienamente umana in vitro di osteoclastogenesis da sangue periferico umano (Figura 3). Durante l’ottimizzazione della metodologia, un numero di punti critici sono stato identificato e risolti. Il primo riguard…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Yibin Kang per fornire la linea cellulare SCP2 e Cristiano Verna per assistenza editoriale.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
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