פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.
Crosstalk בין תאים סרטניים ותאים עצם ב- microenvironment העצם חיוני להבנת מנגנון היווצרות גרורות העצם. פיתחנו במבחנה אנושית לחלוטין פרה מודל של תרבות משותפת של תאים סרטניים בשד ומונוציטים שעברו התמיינות לכיוון osteoclasts. אנחנו אופטימיזציה מודל של osteoclastogenesis החל מדגימת דם היקפיים שנאספו מתורמים מאוד בריאים. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) היו הראשונים המופרדים באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות, נזרע על צפיפות גבוהה, המושרה להבדיל על-ידי הוספת שני גורמי גדילה (GFs): קולטן activator ושל הפקטור הגרעיני-κB ליגנד (רנקל) מקרופאג המושבה-מגרה גורם (MCSF). התאים היו עזב בתרבות למשך 14 ימים קבוע ואז נותחו על ידי ניתוח במורד הזרם. גרורות בעצמות osteolytic, הוא אחד מאפקטי ההגעה התא סרטן בתוך עצם אינדוקציה של osteoclastogenesis. אנחנו ובכך לערער את המודל שלנו עם תרבויות המשנה של תאים סרטניים בשד ללמוד את הכוח התמיינות של תאים סרטניים ביחס של GFs. דרך פשוטה של הלומדים סרטן התא-אוסטאוקלסט אינטראקציה היא לבצע עקיפה תרבויות שיתוף המבוסס על שימוש בינוני ממוזגים שנאסף תרביות תאים של סרטן השד, מעורב בינוני טריים. תערובת זו משמש לאחר מכן לזירוז אוסטאוקלסט בידול. אנחנו גם אופטימיזציה שיטה ישירה תרבות משותפת שבה סרטן תאים ומונוציטים שעברו התמיינות לשתף המדיום ולהחליף גורמים המופרש. זהו שיפור משמעותי על פני השיטה תרבות שותף עקיף המקורי כמו חוקרים ניתן לצפות את האינטראקציות הדדיים של תא שני סוגי ולבצע ניתוחים במורד הזרם עבור תאים סרטניים והן osteoclasts. שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את השפעת הסמים על microenvironment את עצם גרורתית, לקווים תא זרע מלבד אלה נגזר מסרטן השד. המודל יכול לשמש גם כדי לחקור מחלות אחרות כגון אוסטאופורוזיס או תנאים אחרים העצם.
העצם הוא אתר משותף של גרורות של סוגים שונים של גידולים ראשי כמו סרטן הערמונית, ריאות, שד, עם 20-25% מהחולים לפתח גרורות בעצמות במהלך המחלה1,2,3. בפרט, 70% של חולי סרטן השד לשאת עדות עצם גרורות מוות4. הגידול ותא סטרומה האינטראקציה הוא חיוני עבור התקדמות סרטן סרטן ראשוני והן נגעים משניים. ב- microenvironment העצם, גרורות בעצמות osteolytic מסרטן השד תלויים הקמת מעגל קסמים פתולוגיים המתרחשים בין תאים סרטניים, תאים עצם microenvironment של העצם. תאים סרטניים לשבש את איזון עצמות, הגדלת העצם resorption5,6,7.
בתנאים נורמליים ופתולוגיים, osteoclasts הם תאים האחראי על ספיגת עצם, ואילו תאי העצם, תוך הפקדת מטריצה חדש, אחראים על עצם חדשה היווצרות8. אוסטאוקלסט פעילות מוסדר על ידי תאי העצם דרך הביטוי של רנקל, אשר נקשר לקולטן שלו דרגה על פני אוסטאוקלסט קדם, גרימת אוסטאוקלסט שלפני היתוך, תהליך הכרחי עבור בידול לתוך osteoclasts בוגרת. אינדוקציה של osteoclastogenesis מגביר ספיגת עצם. מספר רב של מחקרים ויוו השתפרו באופן משמעותי את ההבנה שלנו של עצם גרורות היווצרות9,10,11. תאים סרטניים בשד הגידול העיקרי, microenvironment את עצם perturb עצם הומאוסטזיס, קידום osteoclastogenesis, העצם resorption8. בתרחיש זה, כל מולקולרית האינטראקציות המתרחשות בין תאים סרטניים של osteoclasts בעלות חשיבות מכרעת. כאמור לעיל, מנגנון היווצרות גרורות בעצם יש כבר מבואר בדגמים העכברים ‘ ויוו . עם זאת, בנוסף, את הצורך באישור כל ויוו ניסויים בבעלי חיים על ידי ועדת האתיקה ישנם מספר חסרונות אחרים לביצוע ויוו ניסויים כולל עלויות גבוהות ושיטות גוזלת זמן. מספר סופרים שילבו במודלים פרה ויוו , במבחנה של osteoclastogenesis באמצעות קו מאתר של osteoclasts מראש הנקרא RAW246.79,10,11. החסרונות של מודל זה נובעות מהעובדה כי התאים כבר מחויבים להיות osteoclasts קדם, אינם ממקור אנושי. מסיבות אלו, המחקר translational יפיקו במידה רבה הזמינות של במבחנה אנושית לחלוטין במודלים פרה ללמוד אינטראקציות התא סרטן העצם.
אנחנו אופטימיזציה שיטה של osteoclastogenesis במבחנה החל מ-12,דגימות דם היקפיים אנושי13. Osteoclasts שואבים ומונוציטים, אשר נמצאים, גם אם במידה קטנה, בדגימות דם היקפיים. תאי תאי מופרדות הראשון אריתרוציטים, גרנולוציטים נוכח דם מלא על-ידי Ficoll צפיפות הדרגתי; הם נבחרו אז בזכות היכולת שלהם לדבוק המצע פלסטיק, בניגוד לימפוציטים. לאחר זריעה, תאים מתורבתים למשך 14 ימים. MCSF רנקל GFs הנדרש על-ידי ומונוציטים להבדיל קודם לתוך מקרופאגים ולאחר מכן לתוך osteoclasts14,15בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. MCSF יש צורך לכל משך וזמינותו, ואילו רנקל משמש לזירוז תהליך התמיינות בשלבים המאוחרים של osteoclastogenesis. בשלב מוקדם של בידול, מסייעת MCSF ומונוציטים להתרבות ולשרוד14,15. במהלך החלק השני של osteoclastogenesis, תאים מתמזגים, בוגר כמו osteoclasts, מציג להתפלגות האופיינית של אקטין F בטבעות ולבטא סמני ספציפיים כגון פוספטאז tartrate חסיני חומצה (השמנה) ו קלציטונין קולטן (CTR) 14 , 15. שיטת שלנו מורכב של הוספת MCSF התרבות מונוציט במשך 7 הימים הראשונים של הניסוי, שילוב של MCSF רנקל ימים 7 עד 14. בסוף הניסוי, osteoclastogenesis ניתוח על ידי ספירת תאי הבדיל, כפי שיפורט להלן.
התרבויות מונוציט המושרה להבדיל מאת GFs יוצרות את הבסיס של המודל פרה שלנו. אנחנו אופטימיזציה מערכת תרבות משותפת ללא GFs כדי להבין טוב יותר את הכוח osteoclastogenic של תאים סרטניים בשד. לראשונה פיתחנו מודל של תרבויות שותף עקיף על-ידי הוספת בינוני (80% α-בינונית מזערי חיוניים (α-מ) ו- 20% ממוזגים בינוני שנאספו מתרבות של תאים סרטניים בשד כי היו confluent כ 90% תאים שעברו התמיינות12 . המדיום ממוזגים (לא נאסף בתנאים מניעת סרום) נאספה לאחר 24 שעות, מעורב בינוני טריים-שיעור של 1:4. המדיום ממוזגים המושרה בידול אוסטאוקלסט משמעותית ביחס הפקד שלילי. עם זאת, כל המידע על האינטראקציה הדדית בין תאים סרטניים ותאים עצם אובדים בעת שימוש עקיף תרבויות המשנה, אנחנו שיפור המערכת שלנו על-ידי ביצוע ישיר תרבויות המשנה. אנחנו נזרע תאים סרטניים 0.4 מיקרומטר מוסיף והניח אותם בבארות שבו תאי תאי מצופים. באמצעות שיטה זו, תאים לשתף המדיום אותו ולהחליף חלבוני המופרש. לכן יצרנו דגם פרה אנושית לחלוטין של osteoclastogenesis הנגרם על ידי תאי סרטן13.
מערכת זו הוא תכליתי מאוד והוא יכול לשמש למטרות מחקריות שונות, למשל, במחקרים תרופתי חוקרים את התפקיד של סמים בתוך עצם גרורות. המודל שלנו מאפשר ללמוד את היעילות ואת מנגנוני הפעולה של טיפולים, ממוקדות עצם ו/או תרופות antitumor microenvironment העצם בנוכחות תאי סרטן13. תכנון הניסויים עם בקרות הנכון, כלומר, תאים סרטניים osteoclasts תרבותי בנפרד, מקל להבין את ההשפעה של תרבות משותפת על פעילות התרופה. גישה זו הופך להיות מעניין יותר כאשר הסם נחקר מטרות הן סרטן תאים ועוד osteoclasts, למשל, everolimus16. מודל זה יכול לשמש גם כדי לזהות מסלולים חדשים של אינטראקציה בין תאים סרטניים ותאים העצם.
פרה במבחנה מודלים לומד על מנגנוני crosstalk בין תאים סרטניים ותאים עצם נחוצים כדי לזהות מנגנונים של עצם גרורות יכול לשמש ליצירת אסטרטגיות טיפוליות חדשות. פיתחנו מודל אנושית לחלוטין במבחנה של osteoclastogenesis מדם היקפי אנושי (איור 3). במהלך אופטימיזציה של המתודולוגיה, מספר נ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות קאנג Yibin למתן את שורת התאים SCP2 ולורנה כריסטיאנו לסיוע העריכה.
αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |