Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays
Summary
Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.
Abstract
Muitas vezes celular comportamento e respostas celulares são analisadas a nível de população onde as respostas de muitas células são agrupadas como um resultado médio, mascarando o comportamento de ricos única célula dentro de uma população de complexo. Tecnologias de deteção e quantificação de proteínas de célula única têm feito um impacto notável nos últimos anos. Aqui nós descrevemos uma plataforma de análise de prático e flexível única célula baseada em microarrays endereçável da gota. Este estudo descreve como o número de cópias absoluta de proteínas do alvo pode ser medido com resolução de célula única. O tumor supressor p53 é o gene mais comumente mutado em câncer humano, com mais de 50% dos casos de câncer total, exibindo um padrão de expressão de p53 não-saudável. O protocolo descreve as etapas para criar 10 gotas de nL, dentro do qual as células de câncer humano único são isoladas e o número de cópia da proteína p53 é medido com resolução única molécula determinar com precisão a variabilidade na expressão. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula incluindo material primário para determinar o número de cópia absoluta de qualquer proteínas alvo de interesse.
Introduction
O objetivo desse método é determinar a variação em abundância de uma proteína do alvo em uma população celular com resolução de célula única. Análise única célula fornece uma série de benefícios que não estão disponíveis com métodos bioquímicos tradicionais ensemble. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 em primeiro lugar, trabalhando no nível da célula única pode capturar a heterogeneidade rica de uma população de células que seria perdida caso contrário calculando a média do que ocorre com técnicas bioquímicas ensemble tradicional. A maioria dos métodos bioquímicos de cavalo de trabalho funciona com a maior parte, exigindo, como muitas vezes, milhões de células para produzir um resultado. Claro, as consequências da avaliação das populações de célula inteira depende de uma série de fatores, por exemplo, a heterogeneidade na expressão da proteína, onde algumas características importantes da distribuição de abundância de proteína podem ser perdidas. Do ponto de vista prática, a sensibilidade necessária de técnicas única célula torná-los capazes de trabalhar com quantidades de material biológico que é insuficiente para nem as técnicas em massa mais sensíveis funcionar. Um exemplo chave é o estudo dos tipos de células raras como circulantes de células de tumor (CTC) onde menos de 10 CTC pode estar presentes no sangue único 7,5 mL desenhar mesmo para pacientes com uma perspectiva de prognóstico pobre. 6 aqui apresentamos a metodologia necessária para realizar as medições de proteína de célula única usando um volume reduzido, ensaio baseado em anticorpos empregando gotículas de óleo-tampado impresso em um microarray do anticorpo.
Plataformas de gotículas microfluídicos são alto throughput, capaz de gerar milhares de gotas por segundo e capaz de isolar e até mesmo cultivo, células únicas em gotículas individuais para executar uma ampla gama de ensaios bioquímicos. Técnicas baseadas em gotículas são adequadas para a análise da única célula,7,8,9 com notáveis exemplos recentes incluindo DropSeq10 e inDrop11, que tem sido grandemente ajudado pelo poder de técnicas de amplificação. A quantidade limitada de material e não métodos de amplificação para proteínas tornam única célula proteomics especialmente desafiador.
As gotas podem ser analisadas por um número de métodos e microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada. Técnicas de molécula como a microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total permite moléculas fluorescentes ser visualizado com incomparável relação sinal-ruído. 12 devido ao decaimento exponencial do campo evanescente, apenas fluorophores alta próximo à superfície (ordem de 100nm) são excitadas fazendo TIRF uma boa estratégia na detecção de pequenas quantidades de uma molécula-alvo em uma mistura complexa. A força de corte óptica inerente de TIRF também ajuda a evitar as etapas de lavagem e ensaio de limites de tempo e complexidade. No entanto, TIRF requer superfícies planas e exemplos de microscopia TIRF aplicado em gotículas no fluxo envolvem a formação de uma superfície plana, de que a imagem. 13 para este fim, técnicas de proteomic única célula frequentemente projetar chips microfluídicos em torno de agentes de superfície-imobilizado captura em um formato de microarray. 4 , 14
As gotas, eles mesmos, podem ser formadas em matrizes em superfícies planas, chamados gotículas microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotículas em matrizes permite-lhes ser convenientemente indexados, facilmente monitorados ao longo do tempo, individualmente abordados e, se necessário, obtida. Microarrays da gota pode alcançar uma elevada densidade de microreatores com milhares de elementos por chip que são free-standing ou suportadas por estruturas de microplacas. 18 , 19 , 20 eles podem ser formados pela deposição sequencial por robôs de manipulação de líquidos, observadores de jato de tinta, entre em contato com microarrayers21,22,23,24,25, 26 , ou eles podem montar auto em superfícies como superhydrophillic pontos estampados em uma superfície de superhydrophobic. 27 , 28 , 29
Com estas considerações em mente, endereçável Droplet Microarrays (ADMs) foram projetados para combinar a versatilidade, capacidade de endereçamento espacial e volumes reduzidos de microarrays da gota com a sensibilidade de microscopia TIRF única molécula para quantitativamente medir a abundância de proteínas. 5 ADMs permitem análise única célula formando um microarray de gotículas contendo células únicas sobre um microarray do anticorpo, que é então coberto com óleo para evitar a evaporação. Os volumes das gotas são discretos para evitar perda de amostra, que caso contrário seria alcançada em-microplaqueta válvulas em microfluídica de fluxo contínuo. 30 a quantidade absoluta de proteína do alvo de uma única célula é extremamente pequena; no entanto, o reduzido volume de gotas permite a concentração local relativamente alta a fim de que eles são detectados usando um sanduíche ensaio de anticorpo – anticorpo é imobilizada em uma região distinta, ou local, sobre uma superfície que capta a proteína, que por sua vez vincula para um anticorpo de detecção fluorescente etiquetado presente no volume da gota. Como uma rótulo abordagem livre (ou seja, proteínas alvos não precisa ser rotulado diretamente), ADMs são geralmente aplicável ao analisar células a partir de fontes primárias, tais como o sangue processado, bem preciso aspirados e biópsias de tumor dissociadas, bem como células de cultura e os lisados.
Medindo a variação em abundância de proteínas através de uma população celular é importante na determinação da heterogeneidade na resposta, por exemplo, para uma droga e vai ajudar no fornecimento de insight funções celulares e vias, avaliando subpopulações e seus comportamento, bem como identificar eventos raros que caso contrário poderia ser mascarados por métodos em massa. Este protocolo descreve como produzir e usar gota endereçável microarrays para determinar quantitativamente a abundância do fator de transcrição p53 em células cancerosas humanas e pode ser usado para investigar o papel de p53 em resposta a quimioterápicos. A proteína alvo é determinada pela escolha dos anticorpos de captura e deteção e pode ser modificada para incluir mais ou diferentes destinos. As instruções são fornecidas para construir um aparato simples, incorporando um bocal concêntrico de consumíveis de laboratório geral de matriz manualmente 10 gotas de nL tampadas com óleo. O processo completo experimental é descrito por meio de que cada gota é então carregada com uma única célula, que é então lysed e a expressão da proteína, determinada com resolução única molécula usando microscopia TIRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endereçáveis da gota de Microarrays são um método sensível e extensível para determinar quantitativamente o número absoluto de cópia da proteína dentro de uma única célula.
Limitar o nível de ligação não-específica (NSB) é fundamental no âmbito do protocolo para alcançar tão baixo limite de detecção como possível. Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica podem ligar para um número de interfaces presentes dentro das gotas — a superfície de lamela, o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR projetado experimentos, desenvolveu protocolos e analisados dados. SC e PS realizaram experimentos de tamanho de célula. ASR e OC escreveram o manuscrito. Os autores desejam reconhecer com gratidão o apoio do Prof David R. Klug para fornecer acesso a equipamentos. Os autores desejam agradecer a faculdade Imperial de Hackspace avançada para acesso às instalações de prototipagem e fabricação.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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