عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]
Summary
نقدم هنا الحبرية عنونة [ميكروارس] (ADMs)، أسلوب صفيف على أساس الحبرية قادراً على تحديد وفرة البروتين المطلق في الخلايا المفردة. علينا أن نظهر قدرة ADMs على تميز عدم التجانس في التعبير عن p53 البروتين القامع الورم في خط خلية سرطان بشرية.
Abstract
ويتم تحليل السلوك كثيرا ما الخلوية والاستجابات الخلوية على مستوى السكان حيث يتم تجميع الردود من العديد من الخلايا معا كنتيجة متوسط إخفاء سلوك خلية مفردة غنية داخل سكان معقدة. جعلت تكنولوجيات الكشف والتحديد الكمي البروتين وحيد الخلية أثرا ملحوظا في السنوات الأخيرة. هنا يصف لنا منصة تحليل عملي ومرن من خلية واحدة استناداً إلى الحبرية عنونة [ميكروارس]. تصف هذه الدراسة كيف يمكن قياس الأرقام المطلقة نسخة من البروتينات المستهدفة مع القرار خلية مفردة. هو p53 القامع الورم الأكثر شيوعاً تحور الجين في السرطان البشري، مع أكثر من 50% حالات سرطان الكلي نستعرض نمط تعبير p53 غير صحية. البروتوكول يصف الخطوات لإنشاء 10 قطرات nL ضمنه الخلايا السرطانية البشرية واحدة معزولة ويتم قياس عدد نسخ البروتين p53 مع القرار جزيء واحد لدقة تحديد التغير في التعبير. قد يتم تطبيق الأسلوب إلى أي نوع من الخلايا بما في ذلك المواد الأولية لتحديد عدد النسخ المطلق من البروتينات المستهدفة أي اهتمام.
Introduction
والهدف من هذا الأسلوب لتحديد التباين في وفرة البروتين المستهدف في عدد سكان خلية مع القرار خلية مفردة. تحليل وحيد الخلية يوفر عددا من المزايا التي لا تتوفر بالطرق البيوكيميائية الفرقة التقليدية. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 أولاً، العمل على مستوى الخلية الواحدة التقاط الغنية عدم تجانس السكان الخلية التي سوف تضيع خلاف ذلك من متوسط الذي يحدث مع التقنيات التقليدية فرقة البيوكيميائية. غالبية الطرق البيوكيميائية الحصان العمل العمل مع الجزء الأكبر، التي تتطلب، كما يفعلون في كثير من الأحيان، ملايين خلايا للحصول على نتيجة. بطبيعة الحال، والمترتبة على تقييم السكان الخلية بأكملها يتوقف على عدد من العوامل، على سبيل المثال، عدم التجانس في التعبير البروتين حيث قد غاب عن بعض الميزات الهامة لتوزيع وفرة البروتين. من منظور عملي، جعلها الحساسية اللازمة لتقنيات خلية واحدة قادرة على العمل مع كميات من المواد البيولوجية التي لا تكفي حتى التقنيات الأكبر أكثر حساسية وظيفة. مثال أساسي لهذا هو دراسة أنواع الخلايا النادرة مثل تعميم ورم الخلايا (ريادية) فيها حتى بالنسبة للمرضى الذين يعانون من نظرة تشخيصية فقراء أقل من 10 ريادية قد تكون موجودة في دم واحد 7.5 مل رسم. 6 هنا نقدم المنهجية اللازمة لإجراء القياسات البروتين وحيد الخلية تخفيض حجم التحليل القائم على جسم تستخدم قطرات النفط توج المطبوعة على ميكرواري جسم استخدام.
هي منصات الحبرية موائع جزيئية عالية الإنتاجية، قادرة على توليد آلاف قطرات في الثانية، وقادرة على عزل، واستزراع حتى، الخلايا المفردة في قطرات الفردية لأداء مجموعة واسعة من الاختبارات البيوكيميائية. الأساليب المستندة إلى الحبرية أيضا مناسبة لتحليل خلية مفردة،7،،من89 مع الأمثلة الأخيرة الجديرة بالذكر بما في ذلك دروبسيق10 وإيندروب11، التي ساعدت إلى حد كبير بقوة تقنيات التضخيم. كمية محدودة من المواد ولا أساليب التضخيم للبروتينات تجعل البروتيوميات خلية مفردة تنطوي على تحديات خاصة.
قطرات قد يتم تحليلها بعدد من الأساليب والفحص المجهري الأسفار وقد استخدمت على نطاق واسع. تقنيات جزيء واحد مثل الانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية تسمح جزيئات الفلورية تصور مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء لا مثيل لها. 12 سبب الانحلال الأسى من ميدان زائل، متحمسون فقط فلوروفوريس بالقرب من السطح (ترتيب 100nm) عالية مما يجعل TIRF استراتيجية جيدة في الكشف عن كميات صغيرة من جزيء الهدف في خليط معقد. قوة تقطيع البصرية المتأصلة TIRF كما يساعد على تجنب خطوات الغسيل والاعتداء حدود الوقت وتعقيد. ومع ذلك، TIRF يتطلب السطوح المستوية وأمثلة للفحص المجهري TIRF المطبقة على قطرات في تدفق تنطوي على تشكيل سطح مستو منها بصورة. 13 تحقيقا لهذه الغاية، تقنيات البروتين وحيد الخلية غالباً تصميم رقائق موائع جزيئية حول عوامل التقاط سطح معطلة في شكل ميكرواري. 4 , 14
قد شكلت القطرات، أنفسهم، في صفائف على الأسطح المستوية الحبرية ما يسمى [ميكروارس]. 15 , 16 , 17 تنظيم قطرات مكانياً في صفائف يسمح لهم بتكون مريح فهرستها بسهولة رصدها مع مرور الوقت وفردية موجهة و، إذا لزم الأمر، استرداد. ويمكن تحقيق الحبرية [ميكروارس] بكثافة عالية من المفاعلات الصغيرة مع آلاف عناصر كل شريحة بذاتها أو تدعمها هياكل ميكروويل. 18 , 19 , 20 أنها قد تكون شكلت بترسب متسلسلة بمناولة السائل الروبوتات، مستطلعين النافثة للحبر، اتصل ميكرواراييرس21،،من2223،،من2425، 26 أو أنها يمكن تجميع ذاتي على السطوح مثل سوبيرهيدروفيليك البقع منقوشة على سطح سوبيرهيدروفوبيك. 27 , 28 , 29
في ضوء هذه الاعتبارات، صممت عنونة الحبرية [ميكروارس] (ADMs) الجمع بين براعة و addressability المكانية وكميات مخفضة من [ميكروارس] الحبرية مع حساسية جزيء واحد TIRF المجهري للكمية قياس وفرة البروتين. 5 ADMs تمكين تحليل خلية مفردة تشكيل ميكرواري الحبرية التي تحتوي على خلايا مفردة أكثر جسم ميكرواري، الذي هو ثم توج بالنفط لمنع التبخر. وحدات تخزين القطرات منفصلة لمنع فقدان عينة، تتحقق إلا بأحكام بصمام على شريحة في تدفق مستمر ميكروفلويديكس. 30 المبلغ المطلق للبروتين الهدف من خلية واحدة صغيرة للغاية؛ ومع ذلك، يسمح تدني حجم القطرات لتركيز المحلية مرتفعة نسبيا كيما يتم الكشف عنها باستخدام مقايسة أضداد ساندويتش-جسم هو المعطل تداولها في منطقة متميزة، أو بقعة على سطح الذي يلتقط البروتين الذي يربط بدوره لجسم فلوريسسينتلي المسمى الكشف عن هذا في حجم قطره. كنهج خالية من التسمية (أي البروتين أهدافا لا تحتاج إلى أن توصف بشكل مباشر)، ADMs قابلة للتطبيق عموما لتحليل الخلايا من المصادر الأولية، مثل الدم المجهزة، وغرامة بحاجة إلى تبين وينتابها ورم الخزعات، فضلا عن خلايا من الثقافة و ما ليساتيس.
قياس التباين في وفرة البروتين عبر سكان خلية مهم في تحديد تباين استجابة، على سبيل المثال، إلى مخدرات وسوف يساعد في توفير نظرة ثاقبة الوظائف الخلوية ومسارات، تقييم الفئات السكانية الفرعية وبهم السلوك، فضلا عن تحديد الأحداث النادرة التي خلاف ذلك سوف يكون مقنعا بأساليب الجزء الأكبر. توضح هذه المقالة كيفية إنتاج واستخدام عنونة الحبرية [ميكروارس] لتحديد الكمية وفرة p53 عامل النسخ في الخلايا السرطانية البشرية هذا البروتوكول ويمكن استخدامها للتحقيق في دور p53 في الاستجابة للعلاج الكيميائي المخدرات. البروتين الهدف يتحدد باختيار الالتقاط والكشف عن الأجسام المضادة ويمكن تعديله لتشمل أهدافا مختلفة أو أكثر. يتم توفير إرشادات لبناء جهاز بسيطة تتضمن فوهة متحدة مركز من لوازم مختبر العامة لصفيف 10 قطرات nL توج بالنفط يدوياً. ويرد وصف عملية تجريبية كاملة بموجبه كل قطره ثم تحميل مع خلية مفردة، ومن ثم تفكيك والتعبير عن البروتين مصممة مع القرار جزيء واحد استخدام الفحص المجهري TIRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
عنونة الحبرية [ميكروارس] أسلوب الحساسة والقابلة للتوسعة لتحديد الكمية عدد النسخ المطلق للبروتين داخل خلية واحدة.
الحد من مستوى الربط غير محددة (أيضا) أمر بالغ الأهمية ضمن البروتوكول إلى تحقيق كانخفاض حد من الكشف عن قدر الإمكان. البروتينات وغيرها من الأنواع الكيميائية الحيو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR تصميم التجارب ووضع البروتوكولات وتحليل البيانات. اتفاقية استكهولم و PS أجرى تجارب حجم الخلية. العصر وقائد كتب المخطوطة. الكتاب يرغب في الاعتراف بامتنان الدعم من البروفيسور ديفيد ر. كلوغ لتوفير إمكانية الحصول على المعدات. المؤلفون أن أتقدم بالشكر “هاكسبيس متقدمة كلية إمبيريال” للوصول إلى مرافق النماذج وتلفيق.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. “One cell-one well”: A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip – Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA – Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
