アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント
Summary
アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm)、単一セルの絶対蛋白質量を決定できる液滴アレイ ・ ベース メソッドをご紹介します。ひと癌細胞における癌抑制タンパク質 p53 の発現の多様性を特徴付けるための Adm の機能を紹介します。
Abstract
しばしば細胞挙動と細胞応答は多くの細胞の応答が複雑な人口の内で豊富な単一のセル動作をマスキング平均結果として一緒にプール、人口レベルで分析しました。単細胞タンパク質検出と定量化技術は、近年顕著な影響を与えたが。ここでアドレス指定可能な液滴マイクロ アレイに基づく実用的で柔軟な単一細胞解析プラットフォームをについて説明します。本研究では、ターゲット蛋白質の絶対コピー数が単一セルの解像度を測定する方法について説明します。腫瘍抑制因子 p53 は、非正常な p53 表現パターンを示す総癌の 50% 以上のひと癌の最も一般的変異遺伝子です。プロトコルでは、発現の変動を正確に判断する単一分子分解能 10 nL 液滴内 1 つのひと癌細胞は隔離され、p53 蛋白のコピー数の測定を作成する手順について説明します。メソッドは、任意のセル型主原料を含む興味の任意のターゲット蛋白質の絶対コピー数を決定するために適用可能性があります。
Introduction
このメソッドの目的は、単一セルの解像度を持つセル人口のターゲット蛋白質の豊富さで変化を決定することです。単一細胞解析は、いくつかの伝統的なアンサンブル生化学的方法では利用できない利点を提供します。1,2,3,4,5まず、単一セルのレベルで働く伝統的なアンサンブル生化学的手法で発生するそれ以外の場合、平均することによって失われるだろう細胞集団の豊富な多様性をキャプチャできます。仕事馬の生化学的方法の大半を連れた、必要とされる職務とは多くの場合、結果を生成する細胞の数百万。もちろん、全体細胞集団の評価の結果によって異なりますいくつかの要因、たとえば、不均質構造タンパク質発現蛋白質量分布のいくつかの重要な機能を見逃す可能性があります。実用的な観点から単一のセル技術の必要な感度させる機能により敏感の一括技術も十分ではない生物学的材料の量を操作することができます。このキーの例は珍しいセルなどの循環癌細胞 (Ctc) 描画単一 7.5 mL の血液に存在する 10 の Ctc より予後見通しで貧しい患者のためにもどこの研究です。6ここでオイル キャップの液滴を用いた抗体アッセイは抗体のマイクロ アレイの印刷量を削減を用いた単一細胞蛋白質測定の実行に必要な方法論を紹介します。
マイクロ液滴プラットフォームは、高スループット、生化学的アッセイの広い配列を実行する個々 のしぶきの滴/秒との分離、及びも培養の単一セルの対応の数千を生成することです。液滴ベースの技術は、単一細胞解析、大幅の力によって支援されています DropSeq10 inDrop11を含む顕著な最近例の7,8,9に最適増幅テクニック。材料の限られた量、蛋白質のための増幅のメソッドは、単一細胞プロテオミクスを特に挑戦的なの作るに。
液滴はメソッドの数によって分析される可能性があり、蛍光顕微鏡が用いられています。全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの単一分子技術により蛍光分子信号対雑音比の比類のない可視化することができます。12によるエバネッ セント場の指数関数的減衰、高 (100 nm オーダー) 表面近傍でのみ fluorophores が付いて興奮している複雑な混合物に少量の標的分子を検出するに全反射の良い戦略を作るします。全反射の光学セクショニング強さまた洗浄手順を避けるために、制限時間と複雑さの分析できます。全反射平面サーフェスを必要とし、流における液滴に適用される全反射型顕微鏡の例を含むイメージを平面の形成。13この目的のために単一細胞プロテオミクス技術設計マイクロ流体チップ マイクロ アレイ フォーマットでキャプチャの表面固定化エージェント周り。4,14
自分自身、液滴を形成して、平坦なサーフェス、いわゆる液滴マイクロ アレイでよい。15,16,17空間的配列に液滴を整理する便利なインデックス、簡単に時間をかけて監視、個別に対処して、必要な場合、取得することができます。液滴マイクロ アレイは、フリースタンディングまたはマイクロウェル構造体でサポートされている、チップあたりの要素の何千もの超小型原子炉の高密度を実現できます。18,19,形成することができる20液体ハンドリング ロボット、インク ジェット マニアによって順次蒸着によって先生方、院生21,22,23,24,25にお問い合わせください 26または彼らは自己 superhydrophillic などの面で組み立てることができるスポットは、超撥水表面のパターンします。27,28,29
念頭に置いてこれらの考慮点は、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm) 定量的に単一分子全反射型顕微鏡の感度と汎用性、空間のアドレッシング機能により、液滴マイクロ アレイのボリュームを減少を結合する設計されていたタンパク質の量を測定します。5 Adm は、蒸発を防ぐためにオイルの蓋は、抗体マイクロ アレイを単一細胞を含む液滴マイクロ アレイを形成する単一細胞分析を有効にします。液滴のボリュームは、オンチップ マイクロ流体連続フローで弁体によって達成されるそれ以外の場合サンプル損失を防ぐ離散。30単一のセルからのターゲット蛋白質の絶対量が非常に小さいです。しかし、水滴の量の削減により比較的高い濃度のため、順序では、彼らはサンドイッチ抗体アッセイを使用して検出されます – 抗体を固定化すると、異なる地域や順番を結合する蛋白質をキャプチャする表面上のスポット蛍光標識検出の抗体, 液滴体積中に存在。ADMs が処理血液などの主要な情報源からの細胞の分析に一般的に適用されるラベル無料アプローチ (すなわちタンパク質のターゲットを直接にラベル付けする必要はありません)、として、うまく吸引解離腫瘍生検と培養細胞を必要とその溶解液。
薬に応答して、たとえば、不均一性を左右する重要な細胞集団全体蛋白質量の変化を測定と細胞機能と経路、集団の評価に洞察力を提供するのに役立つだろう、動作と同様一括方法によってマスクされるまれな事象を識別します。このプロトコルは、生産し、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイを使用して定量的ひとがん細胞における転写因子 p53 の豊かさを確認する方法について説明し、化学療法薬への応答における p53 の役割を調査するために使用可能性があります。ターゲット蛋白質はキャプチャと検出抗体の選択によって決定され、詳細、または別のターゲットを含めるように変更することがあります。手順は、手動でオイルを上限 10 nL 液滴を配列する一般的なラボ消耗品から同心円状のノズルを組み込んだシンプルな装置を構築する提供されます。各液滴分離するか、単一のセル、全反射顕微鏡を用いた 1 分子分解能で決定したタンパク質の発現とロードされるという完全実験のプロセスを説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、単一細胞内でタンパク質の絶対コピー数を決定する定量的敏感かつ拡張可能な方法です。
非特異的結合のレベルを制限すること (NSB) は、低として可能な限り検出限界を達成するためにプロトコル内で重要です。蛋白質および他の生化学的な種がありますバインド インターフェイス液滴内に存在の数非具体的-coverslip 表面、ス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR は、実験を設計プロトコルを開発し、データを分析しました。SC と PS は、セル サイズの実験を行った。ASR では、OC は、原稿を書いていた。著者は機器へのアクセスを提供するため教授デビッド r. Klug のサポートを感謝したいです。著者作製と試作設備にアクセスするために帝国大学高度な Hackspace を感謝したいです。
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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