Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.
Vaak cellulaire gedrag en cellulaire reacties worden geanalyseerd op het bevolkingsniveau waar de reacties van veel cellen samen worden gebundeld als een gemiddelde resultaat maskeren de rijke eencellige gedrag binnen een complexe bevolking. Eencellige eiwit detectie en kwantificering technologieën hebben een opmerkelijke invloed gemaakt in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een praktische en flexibele eencellige analyse platform gebaseerd op adresseerbare druppel microarrays. Deze studie beschrijft hoe de absolute moleculen van doel eiwitten met eencellige resolutie kan worden gemeten. De tumor suppressor p53 is het meestal gemuteerde gen in menselijke kanker, met meer dan 50% van de totale kankergevallen vertoont een patroon van niet-gezonde p53 uitdrukking. Het protocol wordt beschreven stappen voor het maken van 10 nL druppels waarbinnen één menselijke kankercellen worden geïsoleerd en de exemplaaraantal van p53 proteïne wordt gemeten met een enkel molecuul resolutie precies bepalen de variabiliteit in expressie. De methode kan worden toegepast op elk celtype met inbegrip van primaire materiaal om te bepalen van de absolute exemplaaraantal van elke doelgroep proteïnen van belang.
Het doel van deze methode is het bepalen van de variatie in overvloed van een doel-eiwit in een celpopulatie met eencellige resolutie. Eencellige analyse biedt een aantal voordelen die niet beschikbaar met traditionele ensemble biochemische methoden. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in de eerste plaats werken op het niveau van eencellige kan vangen de rijke heterogeniteit van een celpopulatie die anders verloren zou gaan door de gemiddeld dat met traditionele ensemble biochemische technieken optreedt. De meerderheid van de biochemische methoden werkpaard werken met het grootste deel, waarbij, zoals ze vaak doen, miljoenen cellen om een resultaat te produceren. Natuurlijk, de gevolgen voor de beoordeling van de gehele cel populaties hangt af van een aantal factoren, bijvoorbeeld de heterogeniteit in eiwit expressie waar enkele belangrijke kenmerken van de verdeling van eiwit overvloed kunnen worden gemist. Vanuit een praktisch perspectief, de gevoeligheid van eencellige technieken vereist maken hen geschikt voor het werken met hoeveelheden van biologisch materiaal dat onvoldoende is voor zelfs de meer gevoelige bulk technieken om te kunnen functioneren. Een belangrijk voorbeeld hiervan is de studie van zeldzame celtypes zoals circulerende tumorcellen (CTCs) waar zelfs voor patiënten met een slechte prognostische vooruitzichten minder dan 10 CTCs zou aanwezig zijn in een één 7,5 mL bloed trekken. 6 hier presenteren we de methodologie die is vereist voor het uitvoeren van eencellige eiwit metingen met behulp van een verminderde volume antilichaam gebaseerde assay met druppels olie-afgetopte op een microarray antilichaam afgedrukt.
Microfluidic druppel perrons zijn hoge doorvoer, staat voor het genereren van duizenden druppeltjes per seconde, en geschikt voor isoleren, en zelfs kweken, afzonderlijke cellen in afzonderlijke druppels voor het uitvoeren van een breed scala van biochemische tests. Druppel gebaseerde technieken zijn geschikt voor eencellige analyse,7,8,9 met opmerkelijke recente voorbeelden, waaronder DropSeq10 en inDrop11, die aanzienlijk door de kracht van geholpen hebben amplificatie technieken. De beperkte hoeveelheid materiaal en geen methoden voor amplificatie voor eiwitten maken eencellige proteomics vooral een uitdaging.
Druppels kunnen worden geanalyseerd door een aantal methoden en fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt. Enkel molecuul technieken zoals de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie kunt fluorescerende moleculen aan met ongeëvenaarde signal-to-noise verhouding worden gevisualiseerd. 12 als gevolg van de exponentiële afname van het vluchtig veld, alleen fluorophores in de nabijheid van de hoog aan de oppervlakte (volgorde van 100nm) zijn enthousiast maken TIRF een goede strategie voor het opsporen van kleine hoeveelheden van een doelmolecule in een complex mengsel. De inherente optische vectorafbeeldingsbestanden sterkte van TIRF helpt ook om te voorkomen dat wassen stappen en grenzen assay tijd en complexiteit. Echter TIRF vereist vlakke oppervlakken en voorbeelden van TIRF microscopie toegepast op druppels in stroom betrekking hebben op de vorming van een vlakke oppervlakte van die afbeelding. 13 daarom eencellige proteomic technieken vaak ontwerpen microfluidic chips rond oppervlak-geïmmobiliseerd vangen agenten in een microarray opmaken. 4 , 14
De druppels, zelf, kunnen worden gevormd in matrices op vlakke oppervlakken, zogenaamde druppel microarrays. 15 , 16 , 17 ruimtelijk ordenen druppels in arrays kan ze gemakkelijk kunnen worden gunstig geïndexeerd, gecontroleerd na verloop van tijd, individueel gericht en, indien nodig, ontvangen. Druppel microarrays kan het bereiken van een hoge dichtheid van micro-reactoren met duizenden elementen per spaander die vrijstaande of ondersteund door microwell structuren zijn. 18 , 19 , 20 zij kunnen worden gevormd door opeenvolgende afzetting door liquid handling-robots, inkjet spotters, neem contact op met microarrayers21,22,23,24,25, 26 , of ze kunnen zichzelf monteren op oppervlakken zoals superhydrophillic plekken patroon op een superhydrophobic ondergrond. 27 , 28 , 29
Met deze overwegingen in het achterhoofd, werden adresseerbare Droplet Microarrays (ADMs) ontworpen om de veelzijdigheid, ruimtelijke serverprocessor en verminderde hoeveelheid druppel microarrays combineren met de gevoeligheid van een enkel molecuul TIRF microscopie aan kwantitatief maatregel eiwit overvloed. 5 ADMs inschakelen eencellige analyse vormen een druppel microarray met enkele cellen over een microarray antilichaam, die vervolgens wordt afgetopt met olie om te voorkomen dat de verdamping. De volumes van de druppels zijn discrete om verlies van de steekproef, die anders zou kunnen worden bereikt door op de chip kleppen in continue stroom microfluidics te voorkomen. 30 de absolute hoeveelheid eiwit van het doel van een enkele cel is extreem klein; de beperkte omvang van de druppels staat echter voor relatief hoge lokale concentratie opdat zij worden gedetecteerd met behulp van een sandwich antilichaam assay – antilichaam is geblokkeerd in een afzonderlijke regio, of ter plaatse, op een oppervlak dat vangt eiwit die op zijn beurt bindt aan een fluorescently geëtiketteerde detectieantilichaam aanwezig in het volume van de druppel. Als een etiket-vrije benadering (d.w.z. eiwit doelstellingen niet hoeft direct worden geëtiketteerd), ADMs zijn algemeen toepasbaar zijn bij de analyse van cellen uit primaire bronnen, zoals verwerkte bloed, prima moeten aangeblazen en gedissocieerde tumor biopsieën, evenals cellen van cultuur en hun lysates.
Meten van de variatie in eiwit overvloed over een celpopulatie is belangrijk bij het bepalen van de heterogeniteit in reactie, bijvoorbeeld aan een drug en zal helpen bij het verstrekken van inzicht in de cellulaire functies en trajecten, beoordeling van de subpopulaties en hun gedrag, alsmede identificatie van zeldzame gebeurtenissen dat anders zou worden gemaskeerd door bulk methoden. Dit protocol beschrijft hoe kan produceren en gebruiken van microarrays van de adresseerbare druppel kwantitatief bepalen de overvloed van de transcriptie factor p53 in menselijke kankercellen en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van p53 in reactie op chemotherapeutische geneesmiddelen. Het doel eiwit wordt bepaald door de keuze van vastleggen en detectie van antistoffen en kan worden gewijzigd om meer of andere doelen. Instructies om te bouwen van een eenvoudige apparaat opnemen een concentrische mondstuk van algemene lab verbruiksartikelen aan handmatig array 10 nL druppels afgetopt met olie. De volledige experimentele proces wordt beschreven waarbij elke druppel is vervolgens geladen met een enkele cel, die vervolgens is lysed en de uitdrukking van eiwit met enkel molecuul resolutie met behulp van microscopie van TIRF vastgesteld.
Adresseerbaar Droplet Microarrays is een gevoelige en uitbreidbare methode voor het kwantitatief bepalen de absolute exemplaaraantal van eiwit in een enkele cel.
Beperking van het niveau van niet-specifieke binding is (NSB) kritisch in het protocol bij het bereiken van een limiet van detectie mogelijk zo laag. Eiwitten en andere biochemische soorten kan niet-specifiek binden aan een aantal interfaces aanwezig binnen de druppels — het dekglaasje aan oppervlak, het antilichaam ter plaatse en d…
The authors have nothing to disclose.
ASR ontworpen experimenten, protocollen ontwikkeld en geanalyseerd gegevens. SC en PS cel grootte experimenten uitgevoerd. ASR en OC schreef het manuscript. De auteurs willen nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken de steun van Prof. David R. Klug voor het verstrekken van toegang tot apparatuur. De auteurs bedank de Imperial College geavanceerde Hackspace voor toegang tot de fabricage en prototyping faciliteiten.
Cell culture | |||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microarray | |||
Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
Betaine | Sigma | 61962 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Droplets | |||
Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopy & Optics | |||
TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Fiji | Open Source | Image analysis software | |
Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |