Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Summary

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Abstract

Comportement souvent cellulaire et les réponses cellulaires sont analysés au niveau des populations où les réponses de nombreuses cellules sont regroupées ensemble comme un résultat moyen masquant le comportement unicellulaire riche au sein d’une population complexe. Technologies de détection et de quantification protéines unicellulaires ont eu un impact remarquable ces dernières années. Nous décrivons ici une plateforme d’analyse unicellulaire pratique et flexible basée sur gouttelette adressable microarrays. Cette étude décrit comment le nombre de copies absolue de protéines cibles peut-être être mesuré avec une résolution de cellule unique. Le suppresseur de tumeur p53 est le gène le plus fréquemment muté dans le cancer humain, avec plus de 50 % des cas de cancer total expose un modèle d’expression de p53 non saines. Le protocole décrit les étapes pour créer 10 gouttes de nL au sein de laquelle les cellules cancéreuses humaines unique sont isolés et le nombre de copies de la protéine p53 est mesuré avec une résolution de la molécule unique afin de déterminer avec précision la variabilité dans l’expression. La méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule dont la matière première pour déterminer le nombre de copies absolue de toutes les protéines cibles d’intérêt.

Introduction

L’objectif de cette méthode consiste à déterminer la variation dans l’abondance d’une protéine cible dans une population de cellules avec une résolution de cellule unique. Cellule analyse fournit un certain nombre d’avantages qui ne sont pas disponibles avec les méthodes biochimiques ensemble traditionnel. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} tout d’abord, travaillant au niveau de la cellule unique peut capturer l’hétérogénéité riche d’une population cellulaire qui serait autrement perdue par la moyenne qui se produit avec des techniques biochimiques ensemble traditionnel. La majorité des méthodes biochimiques de cheval de travail travaillent avec la plus grande partie, exigeant, comme ils le font souvent, des millions de cellules pour produire un résultat. Bien sûr, les conséquences de l’évaluation des populations de cellules entières repose sur un certain nombre de facteurs, par exemple, l’hétérogénéité dans l’expression de la protéine où certaines caractéristiques importantes de la distribution de l’abondance de la protéine peuvent être manquées. D’un point de vue pratique, la sensibilité requise des techniques de la cellule unique rendent capable de fonctionner avec des quantités de matériel biologique qui est insuffisant pour même les plus sensibles techniques en vrac fonctionner. Un exemple de ceci est l’étude des types de cellules rares tels que les cellules tumorales (CTC) où même pour les patients avec une perspective de pronostique pauvre moins que 10 PTC peut être présent dans un unique 7,5 mL sang tracer en circulation. ⁶ nous présentons ici la méthodologie requise pour effectuer des mesures de protéine monocellulaire en utilisant un test anticorps utilisant des gouttelettes d’huile diablotin imprimé sur un microréseau d’anticorps à volume réduit.

Plateformes de gouttelettes microfluidiques sont haut débit, capable de générer des milliers de gouttelettes par seconde et capable d’isoler et même de la culture, les cellules individuelles en gouttelettes individuels pour effectuer un large éventail de tests biochimiques. Techniques axées sur les gouttelettes sont bien adaptés pour l’analyse de la cellule unique,^7,8,9 , avec des exemples récents notables dont DropSeq¹⁰ et inDrop¹¹, qui ont été grandement aidés par la puissance de techniques d’amplification. La quantité limitée de matériel et aucune méthode d’amplification pour les protéines font unicellulaire protéomique particulièrement difficile.

Gouttelettes peuvent être analysés par un certain nombre de méthodes et la microscopie de fluorescence a été largement utilisée. Techniques de molécules simples telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne permet aux molécules fluorescentes à visualiser avec incomparable rapport signal-bruit. ¹² en raison de la décroissance exponentielle du champ évanescent, seulement des fluorophores dans la grande proximité de la surface (l’ordre de 100 nm) sont excités faisant FRBR une bonne stratégie dans la détection de petites quantités d’une molécule cible dans un mélange complexe. La force de sectionnement optique inhérente de la FRBR contribue également à éviter les lavages et limites de dosage temps et la complexité. Toutefois, la FRBR nécessite des surfaces planes et exemples du microscope TIRF appliqué à gouttelettes en suspension dans le flux impliquent la formation d’une surface plane qui à l’image. ¹³ à cette fin, des techniques protéomiques unicellulaire conçoivent souvent puces microfluidiques autour des agents de surface immobilisée capture dans un format de microarray. ^{4 , 14}

Les gouttelettes, eux-mêmes, peuvent se former dans des tableaux sur des surfaces planes, soi-disant gouttelette microarrays. ^{15 , 16 , 17} organisation dans l’espace des gouttelettes dans les tableaux permet qu’ils soient idéalement indexées, facilement surveillés au fil du temps, individuellement adressée et, le cas échéant, récupérée. Microarrays de gouttelettes peuvent atteindre une forte densité de micro-réacteurs avec des milliers d’éléments par puce qui sont soit encastrées ou pris en charge par une structure de microtitration. ^{18 , 19 , 20} ils peuvent être formés par le dépôt séquentiel par manipulation de liquides robots, jet d’encre spotters, contacter microarrayeurs^{21,22,23,24,25, 26} , ou ils peuvent s’auto-assembler sur des surfaces comme superhydrophillic taches modelée sur une surface SUPERHYDROPHOBE. ^{27 , 28 , 29}

Avec ces considérations à l’esprit, adressable Droplet Microarrays (SMA) ont été conçus pour combiner la polyvalence, les adressabilité spatiale et les volumes réduits de gouttelettes microarrays avec la sensibilité du microscope TIRF seule molécule à quantitativement mesurer l’abondance de la protéine. ⁵ SMA activer l’analyse du unicellulaire formant un microarray de gouttelettes contenant des cellules individuelles sur un microréseau d’anticorps, qui est ensuite coiffée avec de l’huile pour éviter l’évaporation. Les volumes des gouttelettes sont discrètes pour éviter toute perte d’échantillon, qui serait autrement réalisée par sur puce robinetterie en flux continu microfluidique. ³⁰ la quantité absolue de la protéine-cible d’une seule cellule est extrêmement faible ; Toutefois, la diminution du volume des gouttelettes permet de relativement haute concentration locale afin qu’ils soient détectés à l’aide d’un test d’anticorps “sandwich” – anticorps est immobilisé dans une région distincte, ou spot, sur une surface qui capte des protéines qui à son tour se lie à un anticorps de détection fluorescent marqué présent dans le volume de la goutte. Comme une approche sans étiquette (c’est-à-dire des protéines cibles n’ont pas besoin d’être étiquetés directement), SMA est généralement applicables à l’analyse de cellules provenant de sources primaires, tels que le sang transformé, bien besoin de ponction et biopsies tumorales dissociés, ainsi que les cellules de la culture et les lysats.

Mesurant la variation dans l’abondance de la protéine sur une population de cellules est important dans la détermination de l’hétérogénéité en réponse, par exemple, à un médicament et aidera en donnant un aperçu en fonctions cellulaires et voies, évaluation de sous-populations et leur comportement, ainsi que d’identifier des événements rares qui seraient autrement être masquées par des méthodes en vrac. Ce protocole décrit comment produire et utiliser des microarrays gouttelette adressable pour déterminer quantitativement l’abondance de la p53 de facteur de transcription dans des cellules cancéreuses humaines et peut être utilisé pour étudier le rôle de p53 dans la réponse aux médicaments chimiothérapeutiques. La protéine cible est déterminée par le choix de la capture et la détection des anticorps et peut-être être modifiée pour inclure des cibles différentes ou plus. Les instructions sont fournies pour construire un appareil simple incorporant une buse concentrique consommables de laboratoire général d’array manuellement 10 gouttes de nL recouverts d’huile. Le processus complet expérimental est décrit par lequel chaque gouttelette est ensuite chargé avec une seule cellule, qui est ensuite lysée et l’expression de protéine déterminée avec résolution seule molécule TIRF microscopie.

Protocol

1. préparation Faire des copeaux et puces à anticorps impression Fixer un isolant adhésif silicone/acrylique sur un lamelle couvre-objet fonctionnalisé pour prendre en charge un microréseau d’anticorps. Ceci est dénommé la puce.NOTE : Différentes chimies de surface ont été testés pour leur adéquation avec les gouttelettes adressables. 5 surfaces chimies doive être optimisé pour les agents de capture alternative. Isolateurs de SMA sont disp…

Representative Results

Le nombre de copies de protéine basal absolu de p53 a été déterminé avec une résolution de cellule unique dans une lignée de cellules de cancer du côlon humain, cellules BE. Nous démontrons comment expression de p53 peut varier au fil de plusieurs ordres de grandeur et montrent une corrélation faiblement positive entre taille et protéine nombre de copie cellule au sein de la population de cellules BE au repos. Adressa…

Discussion

Adressable Droplet Microarrays sont une méthode sensible et extensible pour déterminer quantitativement le nombre de copies absolue de protéine dans une seule cellule.

Limiter le degré de liaison non spécifique (NSB) est critique au sein du protocole à la réalisation plus bas une limite de détection que possible. Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifique à un certain nombre d’interfaces présentes dans les gouttelettes — la surface de la lamelle couvr…

Materials

Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	10010015
DMEM high glucose	Sigma	D6429
Foetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0115
cell culture flasks	Corning	SIAL0639
Trypsin/EDTA	Biochrom	L2153
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray
Microcontact Arrayer	DigiLab, UK	OmniGrid Micro
Microcontact pin	ArrayIt, USA	946MP2
Coverslips (Nexterion)	Schott, Europe	1098523	Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody	Enzo	ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled	Santa Cruz	sc-126	stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer	Gibco	15557-044
Betaine	Sigma	61962
Sodium dodecyl sulphate	Sigma	L3771
384 well plate (low volume)	Sigma	CLS4511
Nitrogen gas cylinder	BOC	Industrial grade, oxygen-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Droplets
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP2
Manual Microinjector	Eppendorf	CellTram Vario
Micropipette	Origio, Denmark	MBB-FP-L-0
Syringe pumps	KD Scientific	KDS-210
100 μL syringe	Hamilton	81020	Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe	Hamilton	81327	Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator	Grace Bio-Labs	JTR24R-A-0.5	6×4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter	VersaLASE	VLS2.30 CO2 Laser 3W	for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet	Weatherall-UK	Clarex Precision Sheet 001	for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet	3M		used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue	Loctite	LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing	IDEX	FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing	IDEX	1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing	Kinesis	008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing	IDEX	1673
Bovine Serum Albumen (BSA)	Fisher Scientific	BP9700100
Mineral oil	Sigma	M5904
Ultra-pure water	Millipore, Germany	MilliQ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage	Nikon, Japan	Nikon Ti-E
EM-CCD	Andor Technologies, Ireland	IXON DU-897E
Laser excitation source	Vortran, USA	Stradus 488-50
Optical lysis laser source	Continuum, USA	Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF	Chroma, USA	z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis	Laser 2000, UK	LPD01-532R-25
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Fiji	Open Source		Image analysis software
Matlab	Mathworks	version 7.14 or higher	Image analysis software