El objetivo de las pruebas de comportamiento presentada aquí es detectar déficits funcionales en ratas después de la lesión cerebral traumática. Cuatro pruebas específicas se presentan que detectan déficits en conductas que reflejan el daño a áreas específicas del cerebro que a veces se extiende hasta un año después de la lesión.
Con la mayor incidencia de lesión de cerebro traumática (TBI) en poblaciones civiles y militares, TBI ahora se considera una enfermedad crónica; sin embargo, pocos estudios han investigado los efectos a largo plazo de las lesiones en modelos de roedores de TBI. Se muestra aquí son medidas conductuales que están bien establecidas en la investigación TBI para tiempos temprano después de la lesión, como dos semanas, hasta dos meses. Algunos de estos métodos se ha utilizado anteriormente en tiempos posteriores después de la lesión, hasta a un año, pero por muy pocos laboratorios. Los métodos demostraron aquí son una corta evaluación neurológica para probar reflejos, un equilibrio de viga a prueba de equilibrio, un paseo de la viga prueba de equilibrio y coordinación motora y una versión de la memoria de trabajo del laberinto de agua de Morris que puede ser sensible a los déficits en memoria de referencia. Ratas macho se manejaron y previamente entrenados para neurológica, equilibran y coordinación motora pruebas antes de recibir parasagital percusión fluido (FPI) o lesiones sham. Las ratas pueden ser probadas en la evaluación neurológica corto (neuroscore), el equilibrio de viga y la viga-caminata varias veces, durante la prueba en el laberinto de agua sólo se puede hacer una vez. Esta diferencia es porque las ratas pueden recordar la tarea, confundiendo así los resultados si se repite la prueba se intenta en el mismo animal. Cuando la prueba de uno a tres días después de la lesión, se detectaron diferencias significativas en todas las tareas no-cognitivos tres. Sin embargo, las diferencias en la tarea de paseo de la viga no eran perceptibles en más puntos del tiempo (después de 3 meses). Déficits fueron detectados en 3 meses en el viga de Balance y a los 6 meses en el neuroscore. Déficits en memoria de trabajo se detectaron a 12 meses después de lesión, y un déficit en la memoria de referencia apareció por primera vez a los 12 meses. Así, pruebas de comportamiento estándar pueden ser medidas útiles de déficits conductuales persistentes después de FPI.
Los métodos presentados aquí están diseñados para detectar déficits funcionales en áreas específicas del cerebro inducidas por un modelo experimental de TBI en la rata. Se describen cuatro pruebas de comportamiento diferente. En primer lugar, la evaluación neurológica corto, conocida como el neuroscore, se puede realizar sin necesidad de cualquier equipos especializados pero requiere práctica; Esta prueba detecta déficit en los reflejos. En segundo lugar, la prueba de equilibrio de viga detecta déficit en la capacidad de equilibrio. Esta tarea requiere el controlador a la rata basada en una escala ordinal y requiere cierto entrenamiento del controlador. La prueba de equilibrio de viga requiere un haz estrecho y es sensible a los déficits en el sistema vestibular. La tercera prueba evalúa coordinación vestibulomotor. Esta prueba es conocida como la tarea de la viga-a pie, y aunque algún entrenamiento previo de la rata se requiere, este procedimiento es más objetivo que las dos anteriores ya la latencia para atravesar la viga es una medida objetiva que no depende de la puntuación subjetiva. Esta diferencia es porque se mide el tiempo para atravesar un haz estrecho para llegar a una caja de seguridad. La prueba de caminata de la viga requiere un rayo más largo del viga de Balance, así como una caja de escape. Esta prueba mide el déficit en la coordinación motora y equilibrio y por lo tanto es sensible a los daños al cerebelo y áreas del cerebro relacionadas con motor. La versión de la memoria de trabajo del laberinto de agua de Morris (MWM-WM) principalmente pruebas de integración con la corteza prefrontal o la función ejecutiva y función hipocampal. La versión del laberinto acuático de Morris que se muestra puede emplearse para detectar déficits en la memoria de referencia1.
Estos métodos fueron elegidos en base a su historial bien establecido en la literatura. Cada uno ha sido eficaz en muchas manos desde diferentes laboratorios con múltiples cepas de ratas durante numerosos años de investigación. Sin embargo, en el pasado, después de la lesión mide hasta dos semanas después de que lesión se consideraron puntos de tiempo “crónica”. Por lo tanto, para establecer técnicas conductuales para el estudio de los efectos crónicos de TBI en roedores, estos métodos bien conocidos necesarios para evaluar la sensibilidad para detectar TBI inducida por déficits en más puntos del tiempo después de la lesión. Mientras que ahora hay varios modelos de roedores de TBI, el modelo FPI es uno de los más utilizados y se aplica en este estudio. Este modelo fue publicado por primera vez en los años 502, y desde entonces, más de 1.000 documentos han empleado FPI en ratas3. La neuropatología de este tipo de lesiones ha sido bien descrita por nosotros4 y otros5,6,7. Brevemente, lesión neuronal en el hipocampo se ha demostrado para ser dependiente de la dosis utilizando Fluoro-Jade tinción en tiempos cortos después de la lesión, es decir, 24-48 h; mientras que bruto atrofia y cavitación incluyendo adelgazamiento de la cápsula interna y la corteza se ha divulgado en un año después de lesión6,7.
La representación más significativa de la función cerebral se evalúa mediante el uso de medidas de resultado conductuales después de una lesión cerebral experimental. Sin embargo, la gran mayoría de los experimentos FPI que utilicen medidas de resultado conductuales hace medidas relativamente temprano, típicamente de 1 a 14 días después de la lesión. Utilizando los métodos demostró aquí, que algunos déficits conductuales se pueden detectar a 12 meses después de la lesión1. Función neurológica, función de vestibulomotor gruesa y coordinación motora fina se evaluaron en los días después de la lesión (PIDs) 1-3 y en 3, 6 y 12 meses después de la cirugía, mediante una evaluación neurológica corto (Neuroscore; modificado de Schallert8), la Balanza de astil tarea y el paseo de la viga tarea9,10,11. Referencia y memoria de trabajo se evaluaron utilizando una versión de la memoria de trabajo de Morris agua laberinto1,12,13.
Al realizar cualquier tipo de pruebas de comportamiento, es fundamental ser constante. Este detalle incluye muchas consideraciones que parecen insignificantes pero que tienen un impacto importante en la respuesta del animal. Un paso importante que no puede soslayarse es la aclimatación de los animales para su hogar-jaula/situación antes de cualquier experimento. Esta preparación reduce los efectos de la respuesta de estrés fisiológico de los animales, que pueden alterar los resultados conductuales18. Del mismo modo, es absolutamente esencial que cada esfuerzo es hecho para manejar todos los animales de la misma manera. Esta consistencia incluye, como aclimatación se mencionó anteriormente, a la vivienda y aclimatación a manipulación y transporte entre las habitaciones antes del entrenamiento o de prueba. Este concepto no se puede exagerar. Manejo de animales descuidado es desastroso para cualquier prueba comportamiento19. Asimismo, cada esfuerzo debe hacerse para animales de prueba a la misma hora del día, ya sea durante su ciclo de claro u oscuro. Para las pruebas aquí, prueba en fase de claro u oscuro es aceptable, siempre y cuando las pruebas se realizan constantemente. Prueba hecha en diferentes momentos durante el ciclo circadiano se ha demostrado para alterar los resultados conductuales18,20. Además, el controlador, así como el animal debe estar en un estado de calma, libre de estrés para maximizar la exactitud de los resultados.
Particularmente en el caso de lo Neuroscore negativos y falsos positivos son comunes. Falsos positivos ocurren típicamente cuando un animal no es totalmente habituado al manejo y prueba. El animal debe estar completamente relajado la respuesta observada es reflexiva y no debido a los músculos apretando de reacción a estrés o miedo. Un controlador de tensión puede influir en los resultados mediante la transmisión de estrés para el animal. Por lo tanto, manteniendo la rata demasiado apretado o demasiado flojo pueden tanto ser problemáticos. Además, si el controlador está nervioso, esto puede confundir la reacción de las ratas. También existe el riesgo de que un observador inexperto malinterpretan la respuesta de la rata. Buen entrenamiento y mucha práctica son esenciales para el éxito y la consistencia de la Neuroscore.
En general, la preocupación principal con estas pruebas es la falta de una gran diferencia y a veces no hay diferencia, entre grupos de tratamiento. Puesto que los animales pueden reaccionar diferentemente a diferentes controladores, ruidos, veces de día y potencialmente, temporada21, se debe hacer todo lo posible para reducir los posibles factores de confusión.
Los resultados de las tareas de equilibrio de viga y viga-a pie que se muestra a continuación demuestran que estas pruebas son útiles después de lesión para detectar déficits en la función vestibulomotor. Estos déficits suelen resolución por tiempo1,14. En este modelo, a los 6 meses después de lesión, han resuelto los déficit inducidos por la lesión. Los resultados del punto de tiempo de 6 meses indican que no hay diferencias entre INGENUO, simulado o lesionados de las ratas; sin embargo, todas las ratas han sido relajantes en sus jaulas hogar durante 6 meses, envejecimiento y aumentar de peso. Así, por el momento volver a los 6 meses después de la cirugía (o equivalentes en el caso de INGENUO), esencialmente están volviendo viejo y gordo, y por lo tanto todos los grupos no funcionan tan bien como lo hizo frente a sus valores basales día 0 resultados.
Otra consideración importante es que la prueba de comportamiento utilizada es la prueba correcta. Por ejemplo, las pruebas que aquí se piensan para representar la función de áreas específicas del cerebro. Un ejemplo es el sistema vestibular, que es importante para el equilibrio. Áreas del cerebro involucradas en la función sensoriomotora, tales como la corteza incluyendo la corteza sensoriomotora, el tálamo, las neuronas corticoespinales, ganglios basales, nigro-estriado, para nombrar unos pocos, son todos los involucrados en la coordinación de vestibulomotor. Así, los déficits en la balanza de astil o haz caminata indican posibles déficits en estas áreas. Además, el hipocampo y la corteza prefrontal están implicados en el aprendizaje y la memoria las funciones probadas por el laberinto de agua de memoria de trabajo. Incluso cuando se selecciona la prueba correcta, las limitaciones de las pruebas que se emplean deben tenerse en cuenta. Por ejemplo, ninguna de las pruebas presentadas aquí son sensible a los déficits en el estado de ánimo, como depresión, ansiedad o las interacciones sociales tales como impulsividad, agresión y toma de decisiones. Para reiterar, es imprescindible elegir la prueba apropiada para el área de comportamiento y de cerebro ser evaluados.
Interpretación y análisis de datos conductuales deben ser abordados con precaución. Se recomienda incluir análisis de poder de cada tipo de ensayo por separado, ya que, utilizando un resultado conductual como una medida de un déficit neuronal, es por su naturaleza, una medida cruda de un sutil efecto. Además, diferentes pruebas requieren diferentes tipos de análisis estadísticos. Por ejemplo, los ensayos Neuroscore y viga de equilibrio descritos dependen de la interpretación de un observador capacitado para anotar el comportamiento utilizando una escala ordinal. Estos tipos de datos no son continuos y no normalmente distribuido, entonces no paramétrica estadística debe ser utilizada, como el test de Kruskal-Wallis, según lo demostrado en las secciones 6.1 y 6.2. Alternativamente, el paseo de la viga y pruebas de laberinto de agua de memoria de trabajo producen datos que son continuos y normalmente distribuido, tan paramétrica estadística se puede utilizar, como ANOVA unidireccional o medidas repetidas ANOVA dos vías, como se muestra en las secciones 6.3 y 6.4.
Las tareas conductuales presentadas aquí han resistido la prueba del tiempo y dan resultados reproducibles, especialmente cuando se combina con el modelo FPI en ratas, aunque existen muchos otros métodos de pruebas de comportamiento para la lesión cerebral. La neuroscore es una corta evaluación realizada con un mínimo de equipo. Otras pruebas de reflejos y la fuerza están disponibles y podrían incorporarse una evaluación neurológica, como la tarea del lateral de la pulsión, la aquinesia prueba, la prueba del plano inclinado y fuerza de prensión (ver Fujimoto et al. 22 y oro et al. 23). el equilibrio de viga y viga-paseo tareas descritas son las medidas de vestibulomotor déficits después de lesión. Coordinación de Vestibulomotor puede considerarse una medida de comportamiento locomotor bruto, mientras que otras medidas de déficit locomotor bruta incluyen el Rotarod, el poste giratorio y abierta actividad de campo. La capacidad de nadar, medida como velocidad de nado en el laberinto de agua, es también una indicación de la coordinación motora gruesa22,23. La tarea de laberinto de agua de la memoria de trabajo completa este conjunto de pruebas de detección tanto de referencia (indicados por la prueba 1) déficits de la memoria y trabajar déficits de memoria (indicados por Trial 2 o la diferencia entre la prueba 1 y 2 de prueba). Otras medidas de la función cognitiva incluyen el laberinto radial de ocho brazos, el laberinto de Barnes, la prueba de reconocimiento de objetos nuevos y variantes del laberinto de agua. Estas variaciones incluyen el original laberinto acuático de Morris y el laberinto de Lashley III (otra vez ver Fujimoto et al. 22 y oro et al. 23). esta batería de pruebas ha demostrado para ser útil después de lesiones y, en diversos grados, que a 12 meses después de la lesión1.
Además, las tareas demostradas aquí pueden utilizarse con diferentes cepas, sexo y edad de las ratas; sin embargo, puede necesitar alojamiento para diferentes tamaños y en los casos de mayor fragilidad. Por ejemplo, las ratas mayores, más pesadas necesitan un haz más amplio para la tarea de la viga de Balance y las ratas envejecidas, frágiles, puede necesitar laberinto de menor duración de los tiempos de nadar en el agua. Así, hay espacio para la flexibilidad en estas pruebas y potencial para el desarrollo de nuevas pruebas para hipótesis y situaciones diferentes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Ian Bolding asistencia quirúrgica preparación de temas y Elizabeth Sumner para su edición meticulosa. Estos estudios fueron terminados como parte de un equipo financiado por el proyecto de Moody ‘ s de investigación traslacional de lesión de cerebro traumática.
Sprague-Dawley rats | Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287 |
CD-IGS rats, strain code 001 | male, albino, 300-350g at arrival |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Balance | |||
Beam | home built | wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish | |
C-clamp | Home Depot | 1422-C | 2 1/2" |
barrier | Home Depot | styrofoam, 18" x 17 1/2" | |
table (for both BB & BW) | generic office supply | 37" h x 30" w x 60" l | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Walk | |||
Beam | home built | wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor) | |
escape box | home built | woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w | |
nails (pegs) | 2" | ||
hinges | |||
clamps | |||
white noise machine | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf | |
light | Home Depot | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Morris Water Maze | |||
fiberglass pool | manufacturer unknown | ||
(similar to one made by SDI) | San Diego Instruments | 7000-0723 | 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal) |
plexiglass platform | hand-made by Maggie Parsley | 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface | |
(similar to one made by SDI) | SDI | 7500-0272 | |
plexiglass animal boxes w/ lids | UTMB Machine Shop | 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h | |
spot lights/ heat lamps | Home Depot | 3 around pool, 2 over boxes to dry animals | |
AnyMaze | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
/9001 | http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/ |