Het doel van de gedragsmatige tests die hier gepresenteerd is om op te sporen van functionele tekorten bij ratten na traumatisch hersenletsel. Vier specifieke tests worden gepresenteerd die detecteren van tekorten in gedrag aan de schade aan specifieke hersengebieden soms uit te breiden tot één jaar na blessure.
Met de toenemende incidentie van traumatische hersenenverwonding (TBI) in zowel civiele als militaire populaties, TBI wordt nu beschouwd als een chronische ziekte; echter hebben weinig studies onderzocht de langetermijneffecten van letsel in knaagdier modellen van TBI. Hier worden weergegeven zijn gedrags maatregelen die gevestigd in TBI onderzoek voor tijden vroeg na schade, zoals twee weken, tot twee maanden zijn. Sommige van deze methoden zijn eerder gebruikt op latere tijdstippen na letsel, omhoog tot één jaar, maar door weinig laboratoria. De methoden aangetoond hier een korte neurologische beoordeling om te testen reflexen, een Beam-evenwicht aan het testen van evenwicht, een Beam-wandeling voor het testen van balans en coördinatie van de motor, en een werkversie van het geheugen van de Morris water maze die kan gevoelig zijn voor tekorten in verwijst naar geheugen. Mannelijke ratten werden behandeld en vooraf getraind om neurologische, evenwicht, en motorische coördinatie test vóór parasagittal vloeistof percussie letsel (FPI) of sham schade ontvangen. Ratten kunnen worden getest op de korte neurologische beoordeling (neuroscore), de bundel-evenwicht, en de Beam-wandeling meerdere malen tijdens het testen van op het water labyrint kan alleen worden gedaan eenmaal. Dit verschil is omdat ratten de taak herinneren kunnen, dus daarmee de resultaten als herhaald testen wordt geprobeerd in hetzelfde dier. Bij het testen van één tot drie dagen na blessure, worden significante verschillen aangetroffen in alle drie niet-cognitieve taken. Verschillen in de Beam-Walk taak waren echter niet waarneembaar op latere tijdstippen (na 3 maanden). Tekorten zijn waargenomen bij 3 maanden in de Beam-balans en bij 6 maanden in de neuroscore. Tekorten in het werkgeheugen zijn aangetroffen uit tot 12 maanden na verwonding, en een tekort in een referentie-geheugen verscheen voor het eerst op 12 maanden. Zo kunnen gedrags standaardtests nuttige maatregelen van permanente gedrags tekorten na FPI.
De hier gepresenteerde methoden zijn ontworpen om het detecteren van functionele tekorten in specifieke hersengebieden geïnduceerd door een experimenteel model van TBI in de rat. Vier verschillend gedrag tests worden beschreven. Ten eerste, de korte neurologische beoordeling, hierna aangeduid als de neuroscore, kan worden uitgevoerd zonder een gespecialiseerde apparatuur maar vereist praktijk; deze test detecteert tekorten in reflexen. Ten tweede detecteert detest Beam-evenwicht tekorten in het vermogen om evenwicht te brengen. Deze taak vereist van de handler te scoren de rat gebaseerd op een ordinale schaal en vereist enige training van de handler. De Beam-Balance test vereist een smalle bundel en is gevoelig voor tekorten in het vestibulair systeem. De derde test beoordeelt vestibulomotor coördinatie. Deze test staat bekend als de Beam-Walk taak, en hoewel sommige pre opleiding van de rat vereist is, deze procedure is objectiever dan de vorige twee zoals de latentie te doorkruisen de lichtbundel een objectieve maatstaf niet afhankelijk van subjectieve scoren is. Dit verschil is omdat de tijd om te doorkruisen een smalle bundel te bereiken een veilige doos wordt gemeten. De Beam-Walk test vereist een langere lichtbundel dan het Beam-evenwicht, evenals een doos ontsnappen. Deze test meet tekorten in zowel motorische coördinatie en evenwicht en zo is gevoelig voor schade aan het cerebellum en de motor verwante hersengebieden. De werkversie van het geheugen van de Morris water maze (MWM-WM) test voornamelijk hippocampal functie en integratie met de prefrontale cortex of uitvoerende functie. De versie van de Morris water maze komt te staan is ook bruikbaar voor de opsporing van tekorten in verwijzing geheugen1.
Deze methoden werden gekozen op basis van hun gevestigde track record in de literatuur. Elk effectief geweest in vele handen van verschillende laboratoria met meerdere stammen van ratten over verschillende jaren van onderzoek. Echter in het verleden maatregelen na letsel tot twee weken nadat de schade werden beschouwd als “chronische” tijd punten. Dus, om vast te stellen gedrags technieken voor de studie van chronische effecten van TBI in knaagdieren, deze bekende methoden nodig om te worden geëvalueerd om de gevoeligheid voor het detecteren van TBI veroorzaakte tekorten op langere tijd punten na blessure. Hoewel er nu verschillende knaagdieren modellen van TBI, de FPI-model is een van de meest gebruikte, en wordt toegepast in deze studie. Dit model werd voor het eerst gepubliceerd in de jaren 1950-2, en sindsdien hebben meer dan 1.000 artikelen FPI werkzaam in ratten3. Het neuropathologie van dit soort schade is goed beschreven door ons4 en anderen5,6,7. Kort, neuronale schade in de hippocampus is gebleken te zijn dosisafhankelijk met fluor-Jade kleuring op korte momenten na schade, dat wil zeggen, 24-48 h; terwijl het bruto atrofie en cavitatie heeft inclusief dunner worden van de interne capsule en de cortex gemeld één jaar na letsel6,7.
De meest betekenisvolle vertegenwoordiging van hersenfunctie wordt beoordeeld met behulp van gedragsmatige resultaat maatregelen na een experimentele hersenletsel. Echter, de overgrote meerderheid van FPI experimenten die gebruikmaken van gedrags resultaten maken maatregelen relatief vroeg, meestal van 1 tot 14 dagen na blessure. Met behulp van de methoden hier gedemonstreerd, dat sommige gedrags tekorten kunnen worden gedetecteerd uit tot 12 maanden na letsel1. Neurologische functie, bruto vestibulomotor functie en fijne motorische coördinatie werden beoordeeld op na letsel dagen (PID’s) 1-3 en op 3, 6 en 12 maanden na de operatie, met behulp van een korte neurologische beoordeling (Neuroscore; gewijzigd van Schallert8), de Beam-evenwicht taak en de Beam-Walk taak9,10,11. Referentie- en werkgeheugen zijn beoordeeld met behulp van een werkversie van het geheugen van de Morris water maze1,12,13.
Bij het uitvoeren van elk type gedrags testen, is het essentieel om consequent te zijn. Dit detail bevat veel overwegingen die onbelangrijk lijken maar een grote invloed hebben op de reactie van het dier. Een belangrijke stap die niet kan worden overzien is acclimatisering van dieren naar hun huis-kooi/woonsituatie voorafgaand aan elk experiment. Deze voorbereiding vermindert de gevolgen van de dieren fysiologische stress-respons, waardoor het gedrags resultaten18kunnen worden gewijzigd. Ook, is het absoluut noodzakelijk dat alles is gedaan om alle dieren op dezelfde manier. Deze samenhang omvat, als eerder vermeld, acclimatisatie op huisvesting en ook acclimatisering tot behandeling en vervoer tussen kamers voorafgaand aan de training of testen. Dit concept kan niet worden overschat. Slordig dierlijke behandeling is rampzalig om eventuele gedrags test19. Ook moet alles in het werk worden gedaan om te testen dieren op hetzelfde moment van de dag, of tijdens hun donkere of lichte cyclus. Voor de tests hier besproken, is testen in licht of donker fase aanvaardbaar zolang de tests voortdurend worden uitgevoerd. Testen gedaan op verschillende tijdstippen tijdens de circadiane cyclus heeft aangetoond dat het gedrags resultaten18,20te wijzigen. Bovendien, moet de handler evenals het dier in een stress-vrije en kalm staat om de nauwkeurigheid van de resultaten te maximaliseren.
Met name in het geval van de Neuroscore, zijn de valse positieven en negatieven zijn gemeenschappelijk. Valse positieven doen zich meestal voor wanneer een dier is niet volledig gewend tot de behandeling en testen. Het dier moet volledig ontspannen zijn, zodat de waargenomen reactie is reflexief en niet wegens de spieren aanscherping van de reageren op stress of angst. Een gespannen handler kan de resultaten beïnvloeden door verzending van stress bij het dier. Daarom kunnen houden de rat te strak of te los beide worden problematisch. Bovendien, als de handler nerveus is, kan dit de reactie van de ratten beschamen. Er is ook het risico dat een onervaren waarnemer van de rat reactie zal interpreteren. Goede training en veel van de praktijk zijn essentieel voor het succes en de consistentie van de Neuroscore.
In het algemeen, is de voornaamste zorg met deze tests het ontbreken van een groot verschil, en soms geen verschil tussen behandelgroepen. Aangezien dieren verschillend op verschillende handlers, de geluiden, de tijden van de dag, en potentieel, seizoenen21 reageren kunnen, moet elke inspanning worden geleverd om alle mogelijke storende factoren.
De resultaten van de taken van het Beam-evenwicht en Beam-Walk hieronder tonen aan dat deze tests nuttig vroeg na letsel aan het opsporen van tekorten in de vestibulomotor functie. Deze tekorten lossen meestal over tijd1,14. In dit model hebben uiterlijk 6 maanden na schade, de schade-geïnduceerde tekorten opgelost. De resultaten van de 6 maand tijdstip aangeven dat er geen verschillen tussen NAIVE, SHAM of verwonde ratten zijn; echter alle ratten geweest ontspannen in hun huis kooien voor 6 maanden, veroudering en het verkrijgen van het gewicht. Dus tegen de tijd dat ze opnieuw getest op 6 maanden na chirurgie (of equivalent in het geval van NAÏEF zijn), zijn ze in wezen steeds oude en vet, en derhalve alle fracties presteren niet evenals zij in vergelijking met hun basislijn dag 0 resultaten.
Een andere belangrijke overweging is dat de gedrag test gebruikt de juiste test. Bijvoorbeeld, zijn de tests die hier werkzaam gedacht te vertegenwoordigen van de functie van de specifieke hersengebieden. Een voorbeeld is het vestibulaire systeem, dat belangrijk voor evenwicht is. Hersengebieden die betrokken zijn bij sensorimotor functie, zoals de cortex met inbegrip van sensomotorische cortex, de thalamus, de corticospinal neuronen, de basale ganglia, nigro-striatum, te noemen, zijn allemaal betrokken bij coördinatie van de vestibulomotor. Dus, tekorten in het Beam-saldo of Beam-Walk geven mogelijke tekorten in deze gebieden. Bovendien, de hippocampus en de prefrontale cortex zijn betrokken bij het leren en geheugen functies getest door het werk geheugen water labyrint. Zelfs wanneer de juiste test wordt gekozen, moeten de beperkingen van de tests die werkzaam zijn in gedachten worden gehouden. Geen van de tests hier gepresenteerd zijn bijvoorbeeld gevoelig voor tekorten in stemming, zoals depressie, angst of sociale interacties zoals besluitvorming, agressie en impulsiviteit. Nogmaals, is het noodzakelijk om te kiezen van de passende test voor het gebied van het gedrag en de hersenen worden geëvalueerd.
Interpretatie en analyse van gedrags-gegevens moeten met voorzichtigheid worden benaderd. Het is sterk aanbevolen om zijn: macht analyse van elk type proef afzonderlijk, omdat het gebruik van een gedrags resultaat als een maatregel van een neuraal tekort, is door haar aard, een ruwe maat voor een subtiel effect. Bovendien vereisen verschillende tests verschillende soorten statistische analyses. Bijvoorbeeld, zijn de Neuroscore en Beam-evenwicht beschreven proeven afhankelijk van de interpretatie van een getrainde waarnemer te scoren het gedrag met behulp van een ordinale schaal. Deze typen gegevens zijn niet continu en niet normaal verdeelde, dus niet-parametrische statistische gegevens moet worden gebruikt, zoals de Kruskal-Wallis test, zoals aangetoond in de secties 6.1 en 6.2. Als alternatief, de Beam-lopen en werken water doolhof geheugentests gegevens opleveren die continu zijn en normaal verdeelde, dus parametrische statistieken kunnen worden gebruikt, zoals one-way ANOVA of herhaald-maatregelen two-way ANOVA, zoals aangetoond in secties 6.3 en 6.4.
De gedrags taken hier gepresenteerd de tand des tijds hebben doorstaan en geeft reproduceerbare resultaten, met name wanneer in paren gerangschikt met de FPI-model bij ratten, hoewel vele andere methoden voor het testen van de gedragsmatige voor hersenletsel bestaan. De neuroscore is een korte beoordeling uitgevoerd met een minimum van apparatuur. Andere proeven van reflexen en sterkte zijn beschikbaar en kunnen worden opgenomen in een neurologische beoordeling, zoals de laterale scopische taak, de Akinesie test, de test van het hellend vlak en grijpkracht (Zie Fujimoto et al. 22 en gouden et al. 23). the Beam-evenwicht en Beam-Walk taken beschreven zijn maatregelen van vestibulomotor tekorten na blessure. Vestibulomotor coördinatie kan een maatregel van grove motorische gedrag, terwijl andere maatregelen van grove motorische tekorten de Rotarod, de roterende paal omvatten, en veld activiteit open worden beschouwd. De mogelijkheid om te zwemmen, is gemeten als zwemmen snelheid tijdens het doolhof van water, ook een indicatie van grove motorische coördinatie22,23. De werkende geheugen water doolhof taak voltooid deze set van tests door opsporing beide verwijst naar geheugen tekorten (aangegeven door Trial 1) en werken van geheugen tekorten (aangegeven door Trial 2 of het verschil tussen Trial 1 en Trial 2). Andere maatregelen van cognitief functioneren bestaan uit de radiale doolhof van acht arm, het doolhof Barnes, de roman object herkenningstest en verschillende varianten van het water labyrint. Deze varianten omvatten de oorspronkelijke Morris water maze en de doolhof Lashley III (opnieuw Zie Fujimoto et al. 22 en gouden et al. 23). deze batterij van tests is gebleken dat nuttig vroeg na blessure en, in mindere mate, uit tot 12 maanden na letsel1.
Bovendien, kunnen de taken hier gedemonstreerd worden gebruikt met verschillende stammen, seks en ages voor rats; Accommodaties moet echter mogelijk worden gemaakt voor verschillende maten en in het geval van grotere broosheid. Bijvoorbeeld, oudere, zwaardere ratten moeten een bredere bundel voor de Beam-evenwicht taak en leeftijd, frêle ratten, doolhof van moeten kortere duur van zwemmen keer in het water kan. Er is dus ruimte voor flexibiliteit in deze tests en potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe tests voor verschillende situaties en hypothesen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Ian Bolding voor hulp bij chirurgische voorbereiding van onderwerpen en Elizabeth Sumner voor haar zorgvuldige bewerking. Deze studies werden voltooid als onderdeel van een team gefinancierd door The Moody Project voor translationeel traumatische hersenonderzoek letsel.
Sprague-Dawley rats | Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287 |
CD-IGS rats, strain code 001 | male, albino, 300-350g at arrival |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Balance | |||
Beam | home built | wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish | |
C-clamp | Home Depot | 1422-C | 2 1/2" |
barrier | Home Depot | styrofoam, 18" x 17 1/2" | |
table (for both BB & BW) | generic office supply | 37" h x 30" w x 60" l | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Walk | |||
Beam | home built | wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor) | |
escape box | home built | woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w | |
nails (pegs) | 2" | ||
hinges | |||
clamps | |||
white noise machine | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf | |
light | Home Depot | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Morris Water Maze | |||
fiberglass pool | manufacturer unknown | ||
(similar to one made by SDI) | San Diego Instruments | 7000-0723 | 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal) |
plexiglass platform | hand-made by Maggie Parsley | 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface | |
(similar to one made by SDI) | SDI | 7500-0272 | |
plexiglass animal boxes w/ lids | UTMB Machine Shop | 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h | |
spot lights/ heat lamps | Home Depot | 3 around pool, 2 over boxes to dry animals | |
AnyMaze | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
/9001 | http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/ |