L’obiettivo dei test comportamentali qui presentato è quello di rilevare i deficit funzionali in ratti dopo la ferita di cervello traumatica. Quattro test specifici sono presentati che rilevare i deficit nei comportamenti di riflettere i danni ad aree specifiche del cervello a volte che si estende per un anno dopo la ferita.
Con la crescente incidenza del trauma cranico traumatico (TBI) in popolazioni civili e militari, TBI è ora considerata una malattia cronica; Tuttavia, pochi studi hanno studiato gli effetti a lungo termine delle lesioni nei modelli del roditore di TBI. Misure comportamentali che sono ben consolidate nella ricerca TBI per volte presto dopo la lesione, ad esempio due settimane, fino a due mesi, sono indicate qui. Alcuni di questi metodi hanno tradotto stati utilizzati ai tempi più tardi dopo la ferita, fino a un anno, ma da pochissimi laboratori. I metodi hanno dimostrato qui sono una breve valutazione neurologica per testare i riflessi, un equilibrio di fascio per testare l’equilibrio, un fascio-a piedi a prova di equilibrio e coordinazione motoria e una versione di memoria di lavoro del labirinto dell’acqua di Morris che possa essere sensibile ai deficit in memoria di riferimento. I ratti maschii sono stati gestiti e pre-addestrati a neurologico, equilibrio e coordinazione motoria test prima di ricevere la ferita di parasagittal fluido percussioni (FPI) o sham lesioni. Ratti possono essere testati sulla breve valutazione neurologica (neuroscore), l’equilibrio di fascio, e il fascio-a piedi più volte, durante il test il labirinto dell’acqua possono essere fatto solo una volta. Questa differenza è perché ratti possono ricordare l’attività, così confondendo i risultati se ripetuti test viene tentata nello stesso animale. Durante il test da uno a tre giorni dopo la ferita, vengono rilevate differenze significative in tutte le tre attività non cognitive. Tuttavia, le differenze nell’attività fascio-a piedi non erano rilevabili a intervalli di tempo più tardi (dopo 3 mesi). Deficit è stato rilevato a 3 mesi in equilibrio di fascio e a 6 mesi nella neuroscore. I deficit nella memoria di lavoro sono stati rilevati fuori a 12 mesi dopo la ferita, e un deficit in una memoria di riferimento per la prima volta a 12 mesi. Così, test comportamentali standard possono essere utili misure di deficit comportamentali persistenti dopo FPI.
I metodi qui presentati sono progettati per rilevare i deficit funzionali in specifiche aree cerebrali indotte da un modello sperimentale di TBI nel ratto. Quattro prove di comportamento diverso saranno descritti. In primo luogo, la breve valutazione neurologica, indicata come il neuroscore, può essere eseguita senza la necessità di qualsiasi apparecchiatura specializzata ma richiede pratica; Questo test rileva i deficit nei riflessi. In secondo luogo, il test di equilibrio di fascio rileva i deficit nella capacità di equilibrio. Questo compito richiede il gestore di segnare il ratto basato su una scala ordinale e richiede un certo allenamento del gestore. Il test di equilibrio di fascio richiede un fascio stretto ed è sensibile ai deficit del sistema vestibolare. Il terzo test valuta la vestibulomotor coordinamento. Questo test è noto come l’attività di fascio-a piedi, e anche se alcuni pre-allenamento del ratto è necessaria, questa procedura è più obiettivo rispetto alle due precedenti come la latenza per attraversare il fascio è una misura obiettiva non dipende dal punteggio soggettivo. Questa differenza è perché viene misurato il tempo di attraversare un fascio stretto per raggiungere una cassetta di sicurezza. Il fascio-Walk test richiede un fascio più lungo dell’equilibrio di fascio, nonché una casella di fuga. Questo test misura i deficit nella coordinazione motoria e l’equilibrio sia e così è sensibile a danni al cervelletto e aree del cervello relative al motore. La versione di memoria di lavoro del labirinto dell’acqua di Morris (MWM-WM) test principalmente funzione hippocampal e integrazione con la corteccia prefrontale o la funzione esecutiva. La versione del labirinto dell’acqua di Morris mostrato è utilizzabile anche per rilevare i deficit nella memoria di riferimento1.
Questi metodi sono stati scelti in base il loro record di pista ben stabilito nella letteratura. Ognuno è stato efficace in molte mani da diversi laboratori con più ceppi di ratti in numerosi anni di ricerca. Tuttavia, in passato, alberino-ferita di misura fino a due settimane dopo la lesione sono stati considerati punti temporali “cronica”. Così, per definire tecniche comportamentali per lo studio di effetti cronici di TBI in roditori, questi metodi ben noti dovuti essere valutato per la sensibilità rilevare TBI indotto i deficit ai più lunghi intervalli di tempo dopo la ferita. Mentre ora ci sono parecchi modelli del roditore di TBI, il modello FPI è uno dei più utilizzati e viene applicato in questo studio. Questo modello è stato pubblicato nel 1950 ‘ s2, e da allora, più di 1.000 documenti hanno impiegato FPI in ratti3. Il neuropathology di questo tipo di ferita è stata ben descritto da noi4 e altri5,6,7. Brevemente, la lesione di un neurone nell’ippocampo ha dimostrato di essere dose-dipendente con Fluoro-Jade macchiatura in tempi brevi dopo la lesione, vale a dire, 24-48 h; mentre l’atrofia lorda e cavitazione tra cui assottigliamento della capsula interna e corteccia è stato segnalato a un anno dopo la ferita6,7.
La rappresentazione più significativa della funzione del cervello è valutata usando misure comportamentali risultato dopo un trauma cranico sperimentale. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli esperimenti FPI che utilizzano i risultati comportamentali fare misure relativamente presto, in genere da 1 a 14 giorni dopo la ferita. Utilizzando i metodi hanno dimostrato qui, che alcuni deficit comportamentali possono essere rilevati fuori a 12 mesi dopo la ferita1. Funzione neurologica, funzione vestibulomotor lordo e coordinazione motoria sono stati valutati nei giorni di alberino-ferite (PID) 1-3 e a 3, 6 e 12 mesi dopo l’intervento chirurgico, utilizzando una breve valutazione neurologica (Neuroscore; per l’ultima volta da Schallert8), il Compito di equilibrio di fascio e il fascio-passeggiata compito9,10,11. Riferimento e memoria di lavoro sono stati valutati usando una versione di memoria di lavoro del Morris water maze1,12,13.
Quando lo svolgimento di qualsiasi tipo di test comportamentali, è fondamentale essere coerenti. Questo dettaglio include molte considerazioni che sembrano insignificante, ma hanno un impatto importante sulla risposta dell’animale. Un passo importante che non può essere trascurato è acclimatazione degli animali alla loro situazione di home-gabbia/alloggiamento prima di qualsiasi esperimento. Questa preparazione riduce gli effetti della risposta di stress fisiologico degli animali, che possono alterare i risultati comportamentali18. Allo stesso modo, è assolutamente essenziale che ogni sforzo è fatto per gestire tutti gli animali allo stesso modo. Tale coerenza include, come accennato in precedenza, acclimatazione all’abitazione e anche acclimatazione a manipolazioni e trasporti tra camere prima formazione o test. Questo concetto non può essere sopravvalutato. Gestione animale sciatta è disastrosa per qualsiasi test comportamentali19. Allo stesso modo, ogni sforzo deve essere fatto per testare gli animali allo stesso tempo del giorno, sia durante il loro ciclo scuro o chiaro. Per le prove qui discussione, test durante la fase di chiaro o scuro è accettabile, fino a quando i test vengono eseguiti in modo coerente. Test effettuati in tempi diversi durante il ciclo circadiano è stato indicato per alterare i risultati comportamentali18,20. Inoltre, il gestore, nonché l’animale deve essere in uno stato di libero, calma lo stress al fine di massimizzare la precisione dei risultati.
In particolare nel caso di Neuroscore, falsi positivi e negativi sono comuni. Falsi positivi si verificano in genere quando un animale non è completamente abituato alla gestione e al controllo. L’animale deve essere completamente rilassato così la risposta osservata è riflessivo e non a causa di muscoli di serraggio da reagire fuori di stress o di paura. Un gestore teso può influenzare i risultati trasmettendo lo stress per l’animale. Pertanto, tenendo il ratto troppo strette o troppo larghe possono entrambi essere problematici. Inoltre, se il gestore è nervoso, ciò può confondere la reazione dei ratti. C’è anche il rischio che un osservatore inesperto verrà non interpretino correttamente la risposta del ratto. Buon allenamento e un sacco di pratica sono essenziali per il successo e la coerenza della Neuroscore.
In generale, la preoccupazione principale con questi test è la mancanza di una grande differenza e a volte nessuna differenza, tra gruppi di trattamento. Poiché gli animali possono reagire diversamente ai diversi gestori, rumori, ore del giorno e potenzialmente, stagioni21, ogni sforzo deve essere fatto per ridurre tutti i fattori possibili di confusione.
I risultati delle attività di equilibrio di fascio e fascio-passeggiata mostrato qui dimostrano che questi test sono utili presto dopo la ferita per rilevare i deficit nella funzione vestibulomotor. Questi deficit in genere risolvere oltre tempo1,14. In questo modello, entro 6 mesi dopo la ferita, i deficit indotti da lesioni hanno risolto. I risultati del punto di tempo di 6 mesi indicano che ci sono differenze tra NAIVE, SHAM o ratti feriti; Tuttavia, tutti i ratti sono stati rilassanti nelle loro gabbie casa per 6 mesi, invecchiamento e aumento di peso. Così, per il momento che sono ri-testati a 6 mesi post-chirurgia (o equivalente nel caso di INGENUO), essenzialmente stanno diventando vecchio e grasso, e pertanto tutti i gruppi non andò così bene come hanno rispetto ai loro valori basali giorno 0 risultati.
Un’altra considerazione importante è che il test di comportamento utilizzato è quello corretto. Ad esempio, i test impiegati qui sono pensati per rappresentare la funzione di specifiche aree cerebrali. Un esempio è il sistema vestibolare, che è importante per l’equilibrio. Aree del cervello coinvolte nella funzione sensitivo-motoria, come la corteccia tra cui corteccia sensorimotoria, il talamo, i neuroni corticospinali, gangli basali, nigro-striato, per citarne alcuni, sono tutti coinvolti nel coordinamento di vestibulomotor. Quindi, i deficit nell’equilibrio di fascio o fascio-passeggiata indicano potenziali carenze in questi settori. Inoltre, l’ippocampo e la corteccia prefrontale sono coinvolti nell’apprendimento e la memoria funzioni testate da labirinto dell’acqua di memoria di lavoro. Anche quando il test corretto viene scelto, le limitazioni dei test che sono impiegati devono essere tenute presente. Ad esempio, nessuno dei test qui presentati sono sensibili ai deficit di umore, come depressione, ansia o delle interazioni sociali quali aggressioni, processo decisionale o impulsività. Per ribadire, è indispensabile scegliere il test appropriato per l’area di comportamento e cervello da valutare.
Interpretazione e analisi dei dati comportamentali deve essere affrontate con cautela. Si consiglia vivamente di includere analisi di potenza di ogni tipo di prova separatamente, perché, utilizzando un risultato del comportamento come misura di un deficit neurale, è per sua natura, una misura semplice di un effetto sottile. Inoltre, test diversi richiedono diversi tipi di analisi statistiche. Ad esempio, i test di Neuroscore ed equilibrio di fascio descritti dipendono l’interpretazione di un osservatore addestrato a segnare il comportamento utilizzando una scala ordinale. Questi tipi di dati non sono continui e non normalmente distribuite, così non parametriche statistiche devono essere utilizzate, ad esempio il test di Kruskal-Wallis, come dimostrato in sezioni 6.1 e 6.2. In alternativa, il fascio-Walk e prove di lavoro memoria acqua labirinto producono dati che sono continui e distribuite normalmente, così parametriche statistiche possono essere utilizzate, come One-way ANOVA o misure ripetute ANOVA a due vie, come dimostrato in sezioni 6.3 e 6.4.
I compiti del comportamento presentati qui hanno resistito alla prova del tempo e forniscono risultati riproducibili, particolarmente quando accoppiato con il modello FPI in ratti, anche se esistono molti altri metodi di test comportamentali per il trauma cranico. La neuroscore è una breve valutazione eseguita con un minimo di attrezzatura. Altre prove di forza e riflessi sono disponibili e potrebbero essere inseriti in una valutazione neurologica, quali il compito di pulsion laterale, il test di acinesia, il test del piano inclinato e forza prensile (Vedi Fujimoto et al. 22 e oro et al. 23). l’equilibrio di fascio e fascio-passeggiata attività descritte sono misure dei deficit di vestibulomotor dopo la ferita. Vestibulomotor coordinamento può essere considerata una misura del comportamento motorio lordo, mentre altre misure dei deficit motorio lordo includono il Rotarod, il palo rotante e aprire il campo di attività. La capacità di nuotare, misurata come velocità di nuotata durante il labirinto di acqua, è anche un’indicazione di coordinazione motoria lordo22,23. Il compito del labirinto dell’acqua di lavoro memoria completa questo set di test di rilevazione entrambe fanno riferimento i deficit di memoria (indicati da Trial 1) e lavorando i deficit di memoria (indicati da Trial 2 o la differenza tra prova 1 e prova 2). Altre misure della funzione conoscitiva includono il labirinto radiale a otto bracci, il labirinto di Barnes, il test di riconoscimento di oggetto romanzo e diverse varianti del labirinto dell’acqua. Queste variazioni includono l’originale labirinto di acqua di Morris e il labirinto di Lashley III (nuovo Vedi Fujimoto et al. 22 e oro et al. 23). questa batteria di test ha dimostrato di essere utile presto dopo la lesione e, in misura diversa, fuori a 12 mesi dopo la ferita1.
Inoltre, le attività hanno dimostrate qui possono essere utilizzate con diversi ceppi, il sesso ed età dei ratti; Tuttavia, gli alloggi potrebbero essere necessario prevedere diverse dimensioni e nei casi di maggiore fragilità. Per esempio, ratti anziani, più pesante bisogno un fascio più ampio per l’attività di equilibrio di fascio e ratti invecchiati, fragile, potrebbe bisogno di minore durata dei tempi di nuotare nell’acqua labirinto. Così, c’è spazio alla flessibilità in questi test e potenziale per lo sviluppo di nuovi test per ospitare ipotesi e situazioni diverse.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Ian Bolding per assistenza con preparazione chirurgica di soggetti ed Elizabeth Sumner per sua meticolosa di editing. Questi studi sono stati completati come parte di un team finanziato dal The Moody Project per la ricerca di ferita di cervello traumatica traslazionale.
Sprague-Dawley rats | Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287 |
CD-IGS rats, strain code 001 | male, albino, 300-350g at arrival |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Balance | |||
Beam | home built | wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish | |
C-clamp | Home Depot | 1422-C | 2 1/2" |
barrier | Home Depot | styrofoam, 18" x 17 1/2" | |
table (for both BB & BW) | generic office supply | 37" h x 30" w x 60" l | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Walk | |||
Beam | home built | wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor) | |
escape box | home built | woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w | |
nails (pegs) | 2" | ||
hinges | |||
clamps | |||
white noise machine | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf | |
light | Home Depot | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Morris Water Maze | |||
fiberglass pool | manufacturer unknown | ||
(similar to one made by SDI) | San Diego Instruments | 7000-0723 | 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal) |
plexiglass platform | hand-made by Maggie Parsley | 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface | |
(similar to one made by SDI) | SDI | 7500-0272 | |
plexiglass animal boxes w/ lids | UTMB Machine Shop | 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h | |
spot lights/ heat lamps | Home Depot | 3 around pool, 2 over boxes to dry animals | |
AnyMaze | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
/9001 | http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/ |