O objetivo dos testes comportamentais apresentados aqui é detectar déficits funcionais em ratos após lesão cerebral traumática. Quatro testes específicos são apresentados que detectar déficits em comportamentos para refletir o dano a áreas específicas do cérebro, estendendo-se às vezes até um ano após a lesão.
Com a crescente incidência de traumatismo crânio-encefálico (TCE) em populações civis e militares, TBI é considerada uma doença crônica; no entanto, alguns estudos têm investigado os efeitos a longo prazo da lesão em modelos de roedores de TCE. Aqui são mostrados medidas comportamentais que estão bem estabelecidas na pesquisa TBI por vezes cedo depois da lesão, tais como duas semanas, até dois meses. Alguns desses métodos anteriormente foram usados às vezes mais tarde, após a lesão, até a um ano, mas por muito poucos laboratórios. Os métodos demonstrados aqui são reflexos de uma avaliação neurológica curta para testar, um feixe-equilíbrio para testar o equilíbrio, a viga-pé para testar o equilíbrio e coordenação motora e uma versão de memória de trabalho do labirinto de Morris água que pode ser sensível a déficits em memória de referência. Ratos machos foram tratados e treinadas para neurológica, equilíbrio e coordenação motora testa antes de receber a lesão de percussão fluido parassagital (FPI) ou lesão de Souza. Ratos podem ser testados na avaliação neurológica curta (neuroscore), o feixe do equilíbrio, e o feixe-pé várias vezes, durante o teste sobre o labirinto de água só pode ser feito uma vez. Essa diferença é porque ratos podem lembrar a tarefa, confundindo assim os resultados de se repetir o teste é tentada no mesmo animal. Quando o teste de um a três dias após a lesão, diferenças significativas são detectadas em todas as três tarefas não-cognitivo. No entanto, diferenças na tarefa feixe-pé não foram detectáveis em pontos de tempo mais tarde (após 3 meses). Os défices foram detectados em 3 meses no feixe-equilíbrio e em 6 meses no neuroscore. Déficits na memória de trabalho foram detectados por até 12 meses após a lesão, e um défice na memória referência apareceu pela primeira vez em 12 meses. Assim, testes padrão comportamental podem ser medidas úteis de persistentes défices comportamentais depois FPI.
Os métodos apresentados aqui são projetados para detectar déficits funcionais em áreas específicas do cérebro induzidas por um modelo experimental em ratos de TCE. Serão descritos quatro testes de comportamento diferente. Em primeiro lugar, a avaliação neurológica curta, conhecida como o neuroscore, pode ser realizada sem a necessidade de qualquer equipamento, mas requer prática; Este teste detecta déficits em reflexos. Em segundo lugar, o teste do feixe-equilíbrio detecta déficits na habilidade de equilibrar. Esta tarefa exige o manipulador marcar o rato baseado em uma escala ordinal e requer algum treinamento do manipulador. O teste do feixe do equilíbrio requer um feixe estreito e é sensível aos défices no sistema vestibular. O terceiro teste avalia a coordenação de vestibulomotor. Este teste é conhecido como a tarefa de feixe-pé, e embora alguns pre-treinamento do rato é necessário, este procedimento é mais objetivo do que os dois anteriores, como a latência para desviar o feixe é uma medida objetiva não dependente de Pontuação subjetiva. Essa diferença é porque o tempo para atravessar um feixe estreito para alcançar um cofre é medido. O teste de caminhada de feixe requer um feixe mais tempo do que o feixe do equilíbrio, bem como uma caixa de fuga. Este teste mede a déficits na coordenação motora e equilíbrio e, portanto, é sensível a danos para o cerebelo e áreas do cérebro relacionadas motor. A versão de memória de trabalho do labirinto de água Morris (MWM-WM) principalmente testes função hippocampal e integração com o córtex pré-frontal ou função executiva. A versão do labirinto de água Morris mostrado também pode ser usada para detectar os déficits na memória de referência1.
Esses métodos foram escolhidos com base no seu histórico bem estabelecido na literatura. Cada um tem sido eficaz em muitas mãos de laboratórios diferentes com várias cepas de ratos ao longo de vários anos de pesquisa. No entanto, no passado, pós-lesão mede até duas semanas após a lesão foram considerados pontos de tempo “crônica”. Assim, para estabelecer técnicas comportamentais para o estudo dos efeitos crônicos de TCE em roedores, estes métodos conhecidos preciso ser avaliada para a sensibilidade detectar TBI induziram déficits em pontos de tempo mais longos após a lesão. Enquanto existem agora vários modelos de roedores de TCE, o modelo FPI é um dos mais amplamente utilizados e é aplicado neste estudo. Este modelo foi publicado pela primeira vez na década de 19502, e desde então, mais de 1.000 papéis têm empregado FPI em ratos3. A neuropatologia deste tipo de lesão tem sido bem descrita por nós4 e outros5,6,7. Brevemente, lesão neuronal no hipocampo tem demonstrado ser dose-dependente usando Fluoro-Jade coloração pouco tempo após a lesão, ou seja, 24-48 h; enquanto bruta atrofia e cavitação incluindo desbaste da cápsula interna e córtex tem sido relatado em um ano após a lesão de6,7.
A representação mais significativa da função cerebral é avaliada por meio de medidas comportamentais resultado após uma lesão cerebral experimental. No entanto, a grande maioria dos experimentos FPI que usam os resultados comportamentais fazer medidas relativamente cedo, normalmente de 1 a 14 dias após a lesão. Usar os métodos demonstrado aqui, que alguns défices comportamentais podem ser detectados por até 12 meses após a lesão1. Função neurológica, função vestibulomotor bruto e coordenação motora fina foram avaliados nos dias pós-lesão (PIDs) 1-3 e a-3, 6 e 12 meses após a cirurgia, usando uma breve avaliação neurológica (Neuroscore; modificado de Schallert8), o Tarefa de viga de equilíbrio e o feixe-pé tarefa9,10,11. Referência e memória de trabalho foram avaliados usando uma versão de memória de trabalho do Morris água labirinto1,12,13.
Quando realizar qualquer tipo de teste comportamental, é fundamental para ser consistente. Este detalhe inclui muitas considerações que parecem insignificantes, mas tem um grande impacto sobre a resposta do animal. Um passo importante que não pode ser esquecido é a aclimatação de animais para casa-gaiola/moradia antes de qualquer experiência. Esta preparação reduz os efeitos da resposta ao estresse fisiológico dos animais, que podem alterar os resultados comportamentais18. Da mesma forma, é absolutamente essencial que todo esforço é feito para lidar com todos os animais da mesma maneira. Essa consistência inclui, como mencionada anteriormente, aclimatação à moradia e também aclimatação à manipulação e transporte entre quartos antes do treinamento ou teste. Este conceito não pode ser exagerado. Manipulação de animais desleixada é desastrosa para qualquer teste comportamental19. Da mesma forma, todo o esforço precisa ser feita para testar os animais ao mesmo tempo do dia, se durante o seu ciclo escuro ou claro. Para os testes aqui discutidos, testes na fase clara ou escura são aceitável, desde que os testes são realizados de forma consistente. Testes feitos em momentos diferentes durante o ciclo circadiano foi mostrado para alterar os resultados comportamentais18,20. Além disso, o manipulador, bem como o animal deve ser em um estado de calma, livre de stress para aumentar a precisão dos resultados.
Particularmente no caso do Neuroscore, negativos e falsos positivos são comuns. Falsos positivos normalmente ocorrem quando um animal não é totalmente habituado ao manuseio e teste. O animal deve ser completamente relaxado, então a resposta observada é reflexivo e não devido ao aperto da reacção fora de estresse ou medo de músculos. Um manipulador tenso pode influenciar os resultados através da transmissão de estresse para o animal. Portanto, segurando o rato muito solto ou muito apertado podem tanto ser problemáticos. Além disso, se o manipulador estiver nervoso, isso pode confundir a reação dos ratos. Há também o risco de que um observador inexperiente irá interpretar mal a resposta do rato. Bom treinamento e muita prática são essenciais para o sucesso e a consistência da Neuroscore.
Em geral, a principal preocupação com estes testes é a falta de uma grande diferença e às vezes não há diferença, entre os grupos de tratamento. Desde que os animais podem reagir diferentemente a diferentes manipuladores, ruídos, tempos de dia e potencialmente, temporadas21, todo esforço deve ser feito para reduzir todos os possíveis fatores de confusão.
Os resultados das tarefas de feixe-equilíbrio e feixe-pé mostrados aqui demonstram que estes testes são úteis no início após lesão para detectar os déficits na função vestibulomotor. Normalmente estes défices resolução tempo1,14. Neste modelo, por 6 meses após a lesão, resolveram os défices induzida por lesão. Os resultados do ponto de tempo 6 meses indicam que não existem diferenças entre NAIVE, SHAM ou ratos feridos; no entanto, todos os ratos foram relaxantes nas jaulas em casa por 6 meses, envelhecendo e ganhando peso. Assim, quando que eles são re-testados em 6 meses depois da cirurgia (ou equivalentes no caso de INGÊNUO), eles são essencialmente tornar-se velho e gordo, e portanto todos os grupos não executam bem como eles em comparação com sua linha de base dia 0 resultados.
Outra consideração importante é que o teste de comportamento utilizado é o teste correto. Por exemplo, os testes utilizados aqui são pensados para representar a função de áreas específicas do cérebro. Um exemplo é o sistema vestibular, que é importante para o equilíbrio. Áreas do cérebro envolvidas na função sensório-motor, tais como o córtex incluindo córtex sensório-motor, o tálamo, os neurônios corticoespinhal, gânglios basais, nigro-estriado, para citar alguns, são todos os envolvidos na coordenação de vestibulomotor. Assim, déficits no balanço de feixe ou feixe-pé indicam possíveis défices nestas áreas. Além disso, o hipocampo e córtex pré-frontal estão envolvidos na aprendizagem e memória funções testaram pelo labirinto de água de memória de trabalho. Mesmo quando o teste correto é escolhido, as limitações dos testes que são empregados devem ser mantidas em mente. Por exemplo, nenhum dos testes aqui apresentados são sensíveis a défices de humor, como depressão, ansiedade ou interações sociais, tais como agressão, impulsividade ou tomada de decisão. Para reiterar, é imperativo para escolher o teste apropriado para a área de comportamento e cérebro a ser avaliada.
Interpretação e análise de dados comportamentais devem ser abordados com cautela. É altamente recomendável incluir análises de poder de cada tipo de ensaio, separadamente, porque, usando um resultado comportamental como uma medida de um déficit neural, é, por natureza, uma medida bruta de um efeito sutil. Além disso, testes diferentes requerem diferentes tipos de análises estatísticas. Por exemplo, os testes de Neuroscore e feixe-equilíbrio descritos são dependentes a interpretação de um observador treinado para marcar o comportamento usando uma escala ordinal. Esses tipos de dados não são contínuos e estatísticas não é normalmente distribuídas, então não paramétricas devem ser usadas, tais como o teste de Kruskal-Wallis, como demonstrado nas seções 6.1 e 6.2. Alternativamente, o feixe-pé e testes de labirinto de água de memória de trabalho produzem dados que são contínuos e normalmente distribuídas, então paramétricas estatísticas podem ser usadas, como ANOVA One-Way ou medidas repetidas ANOVA de duas vias, conforme demonstrado em seções 6.3 e 6.4.
As tarefas comportamentais apresentadas aqui têm resistido ao teste do tempo e dar resultados reprodutíveis, particularmente quando emparelhado com o modelo FPI em ratos, embora existam muitos outros métodos de ensaio comportamental da lesão cerebral. O neuroscore é uma curta avaliação realizada com um mínimo de equipamento. Outros testes de reflexos e de força estão disponíveis e podem ser incorporados uma avaliação neurológica, tais como a tarefa de pulsão lateral, o teste de acinesia, o teste do plano inclinado e força de preensão (ver Fujimoto et al 22 e ouro et al 23). o feixe-equilíbrio e feixe-pé tarefas descritas são medidas dos défices vestibulomotor após lesão. Coordenação de Vestibulomotor pode ser considerada uma medida do comportamento locomotor bruto, enquanto outras medidas dos défices locomotoras brutos incluem o Rotarod, polo rotativo e abrir a atividade de campo. A capacidade de nadar, medida como velocidade de mergulho durante o labirinto de água, é também uma indicação da coordenação motora bruta22,23. A tarefa de labirinto de água de memória de trabalho conclui este conjunto de testes de detecção de ambos os défices de memória (indicados pelo julgamento 1) de referência e trabalhando os défices de memória (indicados pelo julgamento 2 ou a diferença entre julgamento 1 e 2 de julgamento). Outras medidas da função cognitiva incluem o labirinto radial do oito braço, o labirinto de Barnes, o teste de reconhecimento de objeto romance e diferentes variações do labirinto de água. Estas variações incluem o labirinto de água original Morris e o labirinto de Lashley III (novamente ver Fujimoto et al . 22 e ouro et al 23). esta bateria de testes tem provado para ser útil cedo depois da lesão e, em graus variados, fora a 12 meses após a lesão1.
Além disso, as tarefas demonstradas aqui podem ser usadas com diferentes cepas, sexo e idade dos ratos; no entanto, acomodações podem precisar de ser feitas para diferentes tamanhos e em casos de maior fragilidade. Por exemplo, ratos mais velhos, mais pesados precisam de um raio mais amplo para a tarefa de feixe-equilíbrio e ratos envelhecidos, frágil, pode precisar de menor duração dos tempos de nadar na água de labirinto. Assim, há espaço para a flexibilidade nestes testes e potencial para desenvolvimento de novos testes para acomodar as hipóteses e situações diferentes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Ian Bolding assistência com preparação cirúrgica de temas e Elizabeth Sumner para sua edição meticulosa. Estes estudos foram concluídos como parte de uma equipe financiada pela The Moody projeto para pesquisa de lesão cerebral traumática translacional.
Sprague-Dawley rats | Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287 |
CD-IGS rats, strain code 001 | male, albino, 300-350g at arrival |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Balance | |||
Beam | home built | wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish | |
C-clamp | Home Depot | 1422-C | 2 1/2" |
barrier | Home Depot | styrofoam, 18" x 17 1/2" | |
table (for both BB & BW) | generic office supply | 37" h x 30" w x 60" l | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Walk | |||
Beam | home built | wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor) | |
escape box | home built | woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w | |
nails (pegs) | 2" | ||
hinges | |||
clamps | |||
white noise machine | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf | |
light | Home Depot | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Morris Water Maze | |||
fiberglass pool | manufacturer unknown | ||
(similar to one made by SDI) | San Diego Instruments | 7000-0723 | 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal) |
plexiglass platform | hand-made by Maggie Parsley | 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface | |
(similar to one made by SDI) | SDI | 7500-0272 | |
plexiglass animal boxes w/ lids | UTMB Machine Shop | 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h | |
spot lights/ heat lamps | Home Depot | 3 around pool, 2 over boxes to dry animals | |
AnyMaze | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
/9001 | http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/ |