Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Células Swimmer y Swarmer

Summary

Este protocolo permite la microscopía monocelular de los nadadores diferencialmente distintos de Vibrio parahaemolyticus y células swarmer. El método produce una población de células swarmer fácilmente disponibles para el análisis de células individuales y cubre la preparación de cultivos celulares, inducción de diferenciación de swarmer, preparación de muestras y análisis de imágenes.

Abstract

La capacidad de estudiar la localización intracelular de las proteínas es esencial para la comprensión de muchos procesos celulares. A su vez, esto requiere la capacidad de obtener células individuales para la microscopía de fluorescencia, lo que puede ser particularmente difícil cuando las células de imagen que existen dentro de las comunidades bacterianas. Por ejemplo, el patógeno humano Vibrio parahaemolyticus existe como células nadadoras en forma de varilla corta en condiciones líquidas que al contacto superficial se diferencian en una subpoblación de células swarmer altamente alargadas especializadas para el crecimiento en superficies sólidas. Este artículo presenta un método para realizar análisis de microscopía de fluorescencia de células individuales de V. parahaemolyticus en sus dos estados diferenciales. Este protocolo induce de forma muy reproducible la diferenciación de V. parahaemolyticus en un ciclo de vida de células más swarmer y facilita su proliferación sobre superficies sólidas. El método produce erupciones de células swarmer diferenciadas que se extienden desde tEl borde de la colonia de enjambre. Notablemente, en la punta de las llamaradas de enjambre, las células swarmer existen en una sola capa de células, lo que permite su fácil transferencia a una diapositiva de microscopio y posterior microscopía de fluorescencia de imágenes de células individuales. Además, se presenta el flujo de trabajo de análisis de imágenes para la representación demográfica de sociedades bacterianas. Como prueba de principio, se describe el análisis de la localización intracelular de las matrices de señalización de quimiotaxis en nadadores y células swarmer de V. parahaemolyticus.

Introduction

Las bacterias experimentan constantemente cambios en su entorno externo y han desarrollado varias técnicas para cambiar y adaptar su comportamiento en consecuencia. Uno de estos mecanismos implica la diferenciación en distintos tipos de células que mejor complementan el entorno alterado. La diferenciación suele implicar cambios importantes en la regulación del ciclo celular, la morfología celular y la organización espaciotemporal de las células. Un organismo que puede sufrir diferenciación es Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus pertenece a las Vibrionaceae , que es una familia de proteobacterias que habitualmente habitan agua dulce o salada. Las Vibrionaceae están ampliamente distribuidas en el medio ambiente e incluyen varias especies que causan infecciones del tracto intestinal en humanos, incluyendo también Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus es un organismo dimórfico y es capaz de diferenciarse en dos tipos de células diferentes como una respuesta para acomodar los cambios a suMedio externo. En ambientes acuosos, existe como una célula de nadador en forma de varilla corta con un único flagelo polar situado en el antiguo polo de la célula. Al contacto superficial, se inicia la diferenciación en una célula swarmer. La diferenciación de las células Swarmer implica dos cambios importantes: la morfogénesis de las células swarmer mediante la inhibición de la división celular y la inducción de un segundo sistema de flagelos. Esto da como resultado la formación de una célula swarmer peritricosa y altamente alargada en forma de varilla, que puede continuar con el estilo de vida del swarmer, donde los eventos de división dan como resultado células progenie swarmer, o alternativamente se diferencian de nuevo en células nadadoras.

Se ha informado que varios factores inducen o influyen en la diferenciación del swarmer. El estímulo primario parece ser impulsado por la mechanosensing donde V. parahaemolyticus utiliza el flagelo polar como un sensor táctil que detecta la inhibición de la rotación al contacto superficial, pero varios otros factores están involucrados comoPozo ¹ . En el laboratorio, la rotación del flagelo polar puede inhibirse artificialmente mediante la adición de fenamilo, que bloquea la rotación flagelar conducida por el canal de sodio, induciendo así la diferenciación del swarmer ² . Además, en un estudio anterior, Vibrio alginolyticus se indujo a enjambre en medio sólido cuando las células se propagan en medio de crecimiento en una placa de Petri sellado con cinta de plástico transparente. El papel de filtro saturado con álcali impidió el enjambre en estas condiciones, sugiriendo por lo tanto que uno o más ácidos volátiles podrían estar implicados en la inducción del enjambre. Por lo tanto, el sellado de la placa de Petri con cinta plástica permitió probablemente la acumulación de ácidos volátiles, formados como subproductos del metabolismo celular, dentro del espacio de cabeza de la placa. El mismo efecto se consiguió cuando se añadió H2O2 al medio de crecimiento en placas de Petri no selladas con el fin de producir artificialmente ácidos volátiles por hidrolización de componentes de medios <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . Sin embargo, la identidad de tales ácidos volátiles permanece desconocida. Además, se ha demostrado que la disponibilidad excesiva de calcio ⁶ y limitación de hierro ⁷ mejoran tanto la diferenciación y proliferación de swarmer sobre superficies sólidas. Las células se pueden privar de hierro añadiendo el compuesto 2,2'-bipiridilo al medio de crecimiento, que se ha demostrado que influyen en la diferenciación swarmer [ ^8] . Los factores conocidos para regular la diferenciación se implementan ahora en el diseño de un protocolo que induce reproduciblemente la diferenciación de V. parahaemolyticus en células swarmer y su proliferación en superficies sólidas de agar.

La diferenciación de V. parahaemolyticus implica cambios importantes en la regulación de la división celular, morfología celular y el posicionamiento de máquinas macromoleculares como flagellA y quimiotaxis – procesos que requieren la localización específica de proteínas de acuerdo con el ciclo celular. Por lo tanto, la capacidad para estudiar la localización intracelular de tales proteínas es esencial para la comprensión de los procesos celulares antes mencionados. Para llevar a cabo tales estudios se requiere microscopía de fluorescencia en células individuales. Esto puede ser particularmente difícil cuando las células de imágenes que existen dentro de densas poblaciones bacterianas, como es el caso de las células swarmer. Ha habido intentos de inducir la diferenciación de swarmer en medios líquidos, que podrían generar células individuales para estudios de microscopía. Y aunque a nivel transcripcional estas células han inducido parcialmente el programa de diferenciación swarmer, no sufren los mismos cambios morfológicos distintos que las células swarmer completamente diferenciadas cultivadas en medio sólido ⁸ . Este documento ofrece un protocolo robusto y reproducible de un método para inducir ceLl en una superficie de agar. El protocolo produce una población de células swarmer de fácil acceso fácilmente disponibles para microscopía de célula única y análisis subsiguiente. Además, el protocolo permite estudios de localización de proteínas marcadas fluorescentemente tanto en el nadador como en el swarmer cell-types (secciones 1, 2, 3, 4). Además, el protocolo describe el flujo de trabajo subsecuente sobre cómo procesar y analizar los datos generados a partir de experimentos de microscopía de fluorescencia, lo que permite el análisis demográfico de las sociedades bacterianas (sección 5).

Protocol

1. Preparación de células V. parahaemolyticus electro-competentes y electroporación de ADN de plásmido en células nadadoras NOTA: La siguiente sección del protocolo permite la preparación de células electro-competentes y la posterior electroporación de ADN plasmídico en células nadadoras. Este paso es importante si las proteínas fluorescentes se expresan ectopicamente a partir de un plásmido. Eliminar las células de V. parahaemolyticus de u…

Representative Results

Inducción de la diferenciación y generación de colonias enjambradas La Figura 1 proporciona un esquema de los pasos importantes implicados en la producción de colonias de enjambre de V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Se observó un cultivo de nadador en agar enjambre y se incubó a 24 ° C, induciendo una diferenciación y proliferación de swarmer sobre la superficie s…

Discussion

Este artículo presenta un método para la obtención de imágenes por microscopía de células de V. parahaemolyticus swarmer, seguido de análisis posteriores destinados a resolver y cuantificar la localización subcelular y otras características de las proteínas marcadas fluorescentemente. A pesar de que existen varias herramientas para el procesamiento y análisis de imágenes en microscopía ^{14 , 15 , 16</sup…}

Materials

Media components
LB-medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulated	BD	214510	For preparation of LB agar with LB-medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	For preparation of HI agar swarming plates
Agarose NEEO, ultra quality	Roth	2267.3	For preparation of microscopy agarose pads
Name	Company	Catalog Number	Comments
Additives
L-arabinose	Roth	5118.3	Used to induce pBAD derivatives
2,2`-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	For preparation of HI agar swarming plates
Calcium chloride dihydrate	Roth	5239.1	For preparation of HI agar swarming plates
Ampicillin sodium salt	Roth	K029.3
Chloramphenicol	Roth	3886.3
PBS buffer	–	–	Standard recipe for Phosphate-buffered saline
D(+) Sucrose	Roth	4621.1	For preparation of electrocompetent cells
Glycerol	Roth	3783.5	For preparation of electrocompetent cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Petri dish 150x20mm with cams	Sarstedt	82.1184.500	For preparation of HI agar swarming plates
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	–	Used for drying HI agar swarming plates
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Used for elctroporation of plasmid DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular Devices	–	Used for microscopy image analysis
Excel	Microsoft	–	Used for microscopy data analsis