細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em>腸炎ビブリオ</em>スイマーとスマーマー細胞
Summary
このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。
Abstract
タンパク質の細胞内局在を研究する能力は、多くの細胞プロセスの理解に不可欠です。これは、蛍光顕微鏡検査のための単一細胞を得る能力を必要とし、細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。例えば、ヒト病原体Vibrio parahaemolyticusは、表面接触時に固体表面上での増殖に特化した非常に細長いスマーマー細胞の亜集団に分化する液体状態の短い棒状のスイマー細胞として存在する。本稿では、 V.parahaemolyticusの 2つの異なる状態における単一細胞蛍光顕微鏡分析を行う方法を提示する。このプロトコールは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞ライフサイクルへの分化を非常に再現性よく誘導し、固体表面上でのそれらの増殖を促進する。この方法は、tから伸びる分化したスマーマー細胞のフレアを生成する群れコロニーの縁である。注目すべきは、群れのフレアの先端では、スワマー細胞が細胞の単一層内に存在し、顕微鏡スライドおよびその後の単一細胞の蛍光顕微鏡画像化への容易な移行が可能になることである。さらに、細菌学の人口学的表現のための画像分析のワークフローが提示されている。原理の証明として、V.parahaemolyticusのスイマーおよびスマーマー細胞における走化性シグナル伝達アレイの細胞内局在の分析が記載されている。
Introduction
細菌は、常に外部環境の変化を経験し、それに応じて行動を変化させ適応させるためのいくつかの技術を開発してきた。そのような機構の1つは、変化した環境をよりよく補う別個の細胞型への分化を含む。分化は、しばしば、細胞周期の調節、細胞形態学、および細胞の時空間組織化における主要な変化を伴う。分化を受けることができる1つの生物は、腸炎ビブリオである 。 V.parahaemolyticusはVibrionaceaeに属し、これは通常新鮮なまたは塩水に棲むプロテオバクテリアのファミリーである。 Vibrionaceaeは環境に広く分布しており、Vibrio cholerae.Vを含むヒトに腸管感染を引き起こすいくつかの種を含む。腸炎菌は二形性生物であり、その変化に対応するための応答として2つの異なる細胞型に分化することができる外部環境。水性環境では、それは古い棒状のスイマー細胞として存在し、単一の極性鞭毛が古い細胞極に位置する。表面が接触すると、スマーマーセルへの分化が引き起こされる。スワマー細胞の分化には、2つの大きな変化が含まれる：細胞分裂の阻害によるスワマー細胞の形態形成、および第2の鞭毛系の誘導。この結果、蠕虫状の非常に細長い棒状のスマーマー細胞が形成され、スマーマーライフスタイルを続けることができ、分裂イベントは後代のスマーマー細胞を生じるか、または代わりにスイマー細胞に分化する。
スウォーマーの分化を誘導または影響するいくつかの因子が報告されている。一次刺激は、 V.腸炎菌が表面接触時の回転の阻害を検出する触覚センサとして極性鞭毛を使用するメカノセンシングによって駆動されると思われるが、他のいくつかの要因がウェル1 。実験室では、フェナミルを添加することにより、極性鞭毛の回転を人為的に阻害することができます。フェナミルは、ナトリウムチャネル駆動の鞭毛回転を阻止し、それによりスワマー分化を誘発します2 。さらに、初期の研究では、細胞を透明なプラスチックテープでシールしたペトリ皿中で増殖培地上で増殖させると、 ビブリオ・アルギノリチカスは固体培地上に集まるように誘導された。アルカリ性の濾紙は、これらの条件下での群れを防ぎ、したがって、1つまたは複数の揮発性酸が群れ誘導に関与している可能性があることを示唆している。従って、プラスチックテープでペトリ皿を密封することは、プレートのヘッドスペース内で、細胞代謝の副生成物として形成される揮発性酸の蓄積を可能にする可能性が高い。培地成分を加水分解することによって人工的に揮発性酸を生成するために、シールされていないペトリ皿中で増殖培地にH 2 O 2を添加した場合にも同じ効果が達成された<supclass = "xref"> 3、4、5。それにもかかわらず、このような揮発性酸のアイデンティティは未知のままである。さらに、カルシウム6および鉄制限7の過剰な利用は、固体表面上のスマーマー分化および増殖を促進することが示されている。化合物2,2'-ビピリジルをスウォーマー分化に影響することが示されている増殖培地に添加することにより、細胞を鉄で飢えさせることができる8 。分化を調節することが知られている因子は、スワマー細胞への腸炎ビブリオ寄生虫の分化および固体寒天表面上でのそれらの増殖を再現可能に誘導するプロトコールの設計において現在実施されている。
V.腸炎ビブリオの分化は、細胞分裂、細胞形態の調節、および鞭毛のような巨大分子機械の配置における主要な変化を伴うaおよび走化性装置 – 細胞周期に従ってタンパク質の特異的局在を必要とするプロセス。従って、このようなタンパク質の細胞内局在を研究する能力は、前述の細胞プロセスの理解に必須である。そのような研究を行うためには、単一細胞に対する蛍光顕微鏡法が必要である。これは、スマーマー細胞の場合のように、高密度細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。顕微鏡検査のために単一細胞を潜在的に生成する可能性がある液体培地中のスマーマー分化を誘導する試みがなされている。そして、転写レベルでは、これらの細胞は部分的にスワマー分化プログラムを誘導したが、固体培地上で増殖させた完全に分化したスマーマー細胞と同じ形態変化を受けなかった8 。この論文は、スワーマーを誘発する方法の堅牢で再現性のあるプロトコルを提供する寒天表面での分化。プロトコールは、単一細胞顕微鏡法およびその後の分析のために容易に入手可能な容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生する。さらに、このプロトコールは、スイマー細胞およびスワマー細胞型（セクション1,2,3,4）の両方において蛍光標識タンパク質の局在化研究を可能にする。さらに、このプロトコルは、細菌顕微鏡の人口統計的分析を可能にする蛍光顕微鏡検査（セクション5）から生成されたデータを処理および分析する方法に関する後続のワークフローを記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、 V. parahaemolyticus swarmer細胞の顕微鏡画像化方法とそれに続く下流分析を用いて、細胞内局在および研究された蛍光標識タンパク質の他の特徴を解明および定量する方法を報告する。顕微鏡検査画像処理および分析のためのいくつかのツールが存在するが、V.parahaemolyticusスウォーム細胞の分析は、大部分が高密度細胞集団内に通常存在し、細胞長の変動が大きいために依然とし…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はマックス・プランク・ソサエティによって支持された。
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
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