Inductie van Cellulaire Differentiatie en Single Cell Imaging van<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Zwemmer en zwermcellen
Summary
Dit protocol maakt het mogelijk om de celcellen van een enkele cel te onderscheiden van de differentieel onderscheidende Vibrio parahaemolyticus zwemmer en zwermcellen. De methode produceert een populatie van zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor enkelvoudige celanalyse en behandelt de bereiding van celculturen, inductie van zwarmerdifferentiatie, monsterbereiding en beeldanalyse.
Abstract
Het vermogen om de intracellulaire lokalisatie van eiwitten te bestuderen is essentieel voor het begrijpen van veel cellulaire processen. Op zijn beurt vereist dit de mogelijkheid om enkele cellen te verkrijgen voor fluorescentiemicroscopie, die bijzonder uitdagend kan zijn bij beeldcellen die in bacteriële gemeenschappen bestaan. Bijvoorbeeld bestaat de menselijke pathogeen Vibrio parahaemolyticus als korte staafvormige zwemmercellen in vloeibare omstandigheden die bij oppervlaktecontact onderscheiden maken in een subpopulatie van sterk verlengde zwermcellen die zijn gespecialiseerd voor groei op vaste oppervlakken. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het uitvoeren van single-cell fluorescence microscopy analyse van V. parahaemolyticus in zijn twee differentiële toestanden. Dit protocol stimuleert zeer differentiėle differentiatie van V. parahaemolyticus in een levenscyclus van de zwermcellen en vergemakkelijkt hun proliferatie over vaste oppervlakken. De methode produceert flares van gedifferentieerde zwermcellen die zich uitstrekken van tHij rand van de zwermkolonie. Op het punt van de swarm-flares bevinden zich zwarmercellen in een enkele laag cellen, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden overgebracht naar een microscoopschuif en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-imaging van enkele cellen. Daarnaast wordt de workflow van beeldanalyse voor de demografische representatie van bacteriële samenlevingen gepresenteerd. Als principieel bewijs wordt de analyse van de intracellulaire lokalisatie van chemotaxis signalerende arrays in zwemmer- en zwemmercellen van V. parahaemolyticus beschreven.
Introduction
Bacteriën ervaren voortdurend veranderingen in hun externe milieu en hebben verschillende technieken ontwikkeld om hun gedrag te wijzigen en aan te passen. Een dergelijk mechanisme behelst differentiatie in verschillende celsoorten die de gewijzigde omgeving beter aanvullen. Differentiatie omvat vaak grote veranderingen in de regulering van de celcyclus, celmorfologie en de spatiotemporale organisatie van de cellen. Een organisme dat onderscheid kan ondergaan is Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus behoort tot de Vibrionaceae , een familie van proteobacteriën die gewoonlijk vers of zout water bezitten. Vibrionaceae worden wijd verspreid in het milieu en omvatten verschillende soorten die intestinale infecties veroorzaken bij mensen, ook Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus is een dimorfe organisme en is in staat om te onderscheiden in twee afzonderlijke celtypes als reactie om veranderingen aan te passen aan zijnExtern milieu. In waterige omgevingen bestaat het als een korte staafvormige zwemmercel met een enkele polaire flagellum die zich in de oude celpaal bevindt. Bij oppervlaktecontact wordt differentiatie in een zwarmercellen geactiveerd. Swarmer-celdifferentiatie omvat twee belangrijke veranderingen: zwemmere celmorfogenese door remming van celverdeling en de inductie van een tweede flagella systeem. Dit resulteert in de vorming van een peritriche en sterk verlengde staafvormige zwermcellen, die de zwaartekracht kunnen voortzetten, waarbij divisie-gebeurtenissen resulteren in nageslachtswarmercellen of alternatief in zwemmercellen onderscheiden.
Verschillende factoren zijn gemeld om zwarmerdifferentiatie te beïnvloeden of te beïnvloeden. De primaire stimulus lijkt te worden aangedreven door mechanosensing waar V. parahaemolyticus het polaire flagellum gebruikt als een tactiele sensor die remming van de rotatie detecteert bij oppervlaktecontact, maar er zijn verschillende andere factoren betrokken alsGoed 1 . In het laboratorium kan de rotatie van het polaire flagellum kunstmatig worden geremd door toevoeging van fenamil, die de natriumkanaal gedreven flagellaire rotatie blokkeert, waardoor zwarmer differentiatie 2 wordt geïnduceerd. Bovendien werd Vibrio alginolyticus in een eerdere studie geïnduceerd om te zwermen op vaste media als cellen op groeimedium werden gepropageerd in een Petri-schaal verzegeld met duidelijke plastic tape. Alkali-verzadigd filterpapier voorkomt onder deze omstandigheden zwermen, waardoor erop wordt gewezen dat één of meer vluchtige zuren betrokken kunnen zijn bij inductie van zwermen. Zo verzegelt de Petri schotel met plastic tape die waarschijnlijk is toegestaan voor de accumulatie van vluchtige zuren, gevormd als bijproducten van cellulaire metabolisme, binnen de hoofdruimte van de plaat. Hetzelfde effect werd bereikt wanneer H202 werd toegevoegd aan het groeimedium in niet-afgesloten Petri-schalen om kunstmatig vluchtige zuren kunstmatig te produceren door hydrocomponenten van mediakomponenten <supClass = "xref"> 3 , 4 , 5 . Niettemin blijft de identiteit van dergelijke vluchtige zuren onbekend. Bovendien is gebleken dat overmatige beschikbaarheid van calcium 6 en ijzerbeperking 7 beide zwarmerdifferentiatie en proliferatie op vaste oppervlakken verbeteren. Cellen kunnen uitgehongerd worden voor ijzer door de verbinding 2,2'-bipyridyl aan het groeimedium toe te voegen, dat is aangetoond dat het differentiëren van zwarmeren 8 beïnvloedt. De factoren die bekend zijn om differentiatie te reguleren, worden nu geïmplementeerd in het ontwerp van een protocol dat reproduceren V. parahaemolyticus differentiatie in zwermcellen en hun proliferatie op solide agaroppervlakken induceert.
V. parahaemolyticus differentiatie omvat grote veranderingen in de regulering van celverdeling, cellulaire morfologie en de positionering van macromoleculaire machines zoals flagellA en chemotaxis apparaten – processen die allemaal de specifieke lokalisatie van eiwitten in overeenstemming met de celcyclus vereisen. Zo is het vermogen om de intracellulaire lokalisatie van dergelijke eiwitten te bestuderen essentieel voor het begrijpen van de hiervoor genoemde cellulaire processen. Om dergelijke studies te verrichten is fluorescentiemicroscopie op enkele cellen vereist. Dit kan bijzonder uitdagend zijn bij beeldcellen die in dichte bacteriepopulaties bestaan, zoals bij zwermcellen geldt. Er zijn pogingen gedaan om zwarmerdifferentiatie in vloeibare media te veroorzaken, die mogelijk cellen voor microscopie studies kunnen genereren. En alhoewel deze cellen op transcriptioneel niveau de zwarmer-differentieringsprogramma gedeeltelijk hebben geïnduceerd, ondergaan ze niet dezelfde zelfde morfologische veranderingen als volledig gedifferentieerde zwermcellen die op vast medium 8 worden gegroeid. Dit papier biedt een robuust en reproduceerbaar protocol van een methode om swarmer ce te veroorzakenLl differentiatie op een agar oppervlak. Het protocol produceert een populatie van gemakkelijk toegankelijke zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor single-cell microscopie en daaropvolgende analyse. Bovendien maakt het protocol plaatsbepalingsstudies van fluorescent gelabelde eiwitten in zowel de zwemmer- als zwermercellen (secties 1, 2, 3, 4). Daarnaast beschrijft het protocol de daaropvolgende workflow over het verwerken en analyseren van de gegenereerde data uit fluorescentiemicroscopie experimenten, die het mogelijk maakt de demografische analyse van bacteriële samenlevingen mogelijk te maken (sectie 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel wordt een methode beschreven voor microscopische beeldvorming van V. parahaemolyticus zwarmercellen, gevolgd door stroomafwaartse analyses die bestemd zijn om de subcellulaire lokalisatie en andere eigenschappen van de onderzochte fluorescent gelabelde eiwitten op te lossen en te kwantificeren. Hoewel er meerdere instrumenten bestaan voor microscopische beeldverwerking en analyse 14 , 15 , 16 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Max Planck Society.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
