Dieses Protokoll ermöglicht die Einzelzellmikroskopie der unterschiedlich unterschiedlichen Vibrio parahaemolyticus Schwimmer und Swarmer Zellen. Das Verfahren erzeugt eine Population von Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellanalyse leicht verfügbar sind, und umfasst die Herstellung von Zellkulturen, die Induktion von Swarmer-Differenzierung, Probenvorbereitung und Bildanalyse.
Die Fähigkeit, die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen zu untersuchen, ist für das Verständnis vieler zellulärer Prozesse unerlässlich. Im Gegenzug erfordert dies die Fähigkeit, einzelne Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, was bei der Bildgebung von Zellen, die in Bakteriengemeinschaften existieren, besonders schwierig sein kann. Zum Beispiel existiert der menschliche Pathogen Vibrio parahaemolyticus als kurze stabförmige Schwimmerzellen in flüssigen Zuständen, die bei der Oberflächenkontaktdifferenzierung zu einer Subpopulation von stark verlängerten, auf wässerigen Oberflächen spezialisierten Swarmerzellen differenzieren. Dieses Papier stellt eine Methode zur Durchführung einer Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie-Analyse von V. parahaemolyticus in seinen zwei Differentialzuständen vor. Dieses Protokoll induziert sehr reproduzierbar die Differenzierung von V. parahaemolyticus in einen schnelleren Zelllebenszyklus und erleichtert deren Proliferation über feste Oberflächen. Die Methode erzeugt Fackeln von differenzierten Swarmer Zellen, die sich von t erstreckenEr Rand der Schwarmkolonie. Bemerkenswert, an der Spitze der Schwarm-Fackeln befinden sich Swarmer-Zellen in einer einzigen Schicht von Zellen, die ihre leichte Übertragung auf einen Objektträger und die anschließende Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung einzelner Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wird der Workflow der Bildanalyse zur demographischen Darstellung von Bakteriengesellschaften vorgestellt. Als prinzipielle prüfung wird die Analyse der intrazellulären Lokalisation von Chemotaxisignalisierungsarrays in Schwimmer und Swarmerzellen von V. parahaemolyticus beschrieben.
Bakterien erleben ständig Veränderungen in ihrer äußeren Umgebung und haben mehrere Techniken entwickelt, um ihr Verhalten entsprechend zu verändern und anzupassen. Ein solcher Mechanismus beinhaltet die Differenzierung in verschiedene Zelltypen, die die veränderte Umgebung besser ergänzen. Die Differenzierung beinhaltet oft große Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus, der Zellmorphologie und der räumlich-zeitlichen Organisation der Zellen. Ein Organismus, der sich einer Differenzierung unterziehen kann, ist Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus gehört zu den Vibrionaceae , die eine Familie von Proteobakterien ist, die in der Regel frisches oder Salzwasser bewohnen. Vibrionaceae sind weit verbreitet in der Umwelt und umfassen mehrere Arten, die Darmtrakt-Infektionen beim Menschen verursachen, auch einschließlich Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus ist ein dimorpher Organismus und ist in der Lage, in zwei verschiedene Zelltypen als eine Antwort zu differenzieren, um Änderungen an seinem zu unterscheidenExternes milieu In wässrigen Umgebungen existiert es als eine kurze stabförmige Schwimmerzelle mit einem einzigen polaren Flagellum, das am alten Zellpfosten positioniert ist. Bei Oberflächenkontakt wird die Differenzierung in eine schwärmer Zelle ausgelöst. Die Swarmerzelldifferenzierung beinhaltet zwei wesentliche Veränderungen: die Swarmerzellmorphogenese durch Hemmung der Zellteilung und die Induktion eines zweiten Flagella-Systems. Dies führt zur Bildung einer peritrichen und stark verlängerten stabförmigen Swarmerzelle, die entweder den schwärmeren Lebensstil fortsetzen kann, wo Divisionsereignisse zu Nachkommen-Swarmer-Zellen führen oder alternativ zurück in Schwimmerzellen differenzieren.
Es wurde berichtet, dass mehrere Faktoren die Swarmer-Differenzierung induzieren oder beeinflussen. Der primäre Stimulus scheint durch Mechanosensation angetrieben zu werden, wo V. parahaemolyticus das polare Flagellum als einen taktilen Sensor verwendet, der die Hemmung der Rotation auf den Oberflächenkontakt erkennt, aber einige andere Faktoren sind beteiligtGut 1 Im Labor kann die Rotation des polaren Flagellum künstlich durch Zugabe von Phenamilie gehemmt werden, welches die natriumkanalgetriebene Flagellarrotation blockiert, wodurch die Swarmerdifferenzierung 2 induziert wird. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie Vibrio alginolyticus induziert , um auf festen Medien zu schwärmen, wenn Zellen auf Wachstumsmedium in einer Petrischale, die mit einem klaren Plastikband versiegelt wurde, vermehrt wurden. Alkali-gesättigtes Filterpapier verhinderte, unter diesen Bedingungen zu schwärmen, was darauf hindeutet, dass eine oder mehrere flüchtige Säuren an der Induktion von Schwärmen beteiligt sein könnten. So versiegelte die Versiegelung der Petrischale mit Plastikband wahrscheinlich die Ansammlung von flüchtigen Säuren, die als Nebenprodukte des Zellstoffwechsels gebildet wurden, innerhalb des Kopfraums der Platte. Der gleiche Effekt wurde erreicht, wenn H 2 O 2 dem Wachstumsmedium in nicht versiegelten Petrischalen zugesetzt wurde, um künstlich flüchtige Säuren durch Hydrolyse von Medienkomponenten herzustellen <supClass = "xref"> 3 , 4 , 5 . Dennoch bleibt die Identität solcher flüchtigen Säuren unbekannt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine übermäßige Verfügbarkeit von Calcium 6 und Eisen-Begrenzung 7 sowohl die Swarmer-Differenzierung als auch die Proliferation über feste Oberflächen verstärkt. Die Zellen können für Eisen durch Zugabe der Verbindung 2,2'-Bipyridyl zum Wachstumsmedium verhungert werden, von dem gezeigt wurde, dass sie die Swarmer-Differenzierung beeinflussen 8 Die Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Differenzierung regulieren, werden nun in der Gestaltung eines Protokolls implementiert, das reproduzierbar die V. parahaemolyticus- Differenzierung in schwärmeren Zellen und deren Proliferation auf festen Agaroberflächen induziert.
V. parahaemolyticus Differenzierung beinhaltet große Änderungen in der Regulierung der Zellteilung, zelluläre Morphologie und die Positionierung von makromolekularen Maschinen wie FlagellA und Chemotaxis Apparate – Prozesse, die alle die spezifische Lokalisierung von Proteinen nach dem Zellzyklus erfordern. Somit ist die Fähigkeit, die intrazelluläre Lokalisation solcher Proteine zu untersuchen, für das Verständnis der vorgenannten zellulären Prozesse wesentlich. Um solche Studien durchzuführen, ist eine Fluoreszenzmikroskopie an einzelnen Zellen erforderlich. Dies kann bei der Bildgebung von Zellen, die in dichten Bakterienpopulationen existieren, besonders herausfordernd sein, wie dies bei Swarmer-Zellen der Fall ist. Es gab Versuche, eine schwächere Differenzierung in flüssigen Medien zu induzieren, die potentiell einzelne Zellen für Mikroskopie-Studien erzeugen könnten. Und obwohl auf einer Transkriptionsstufe diese Zellen das Swarmer-Differenzierungs-Programm teilweise induziert haben, unterliegen sie nicht denselben deutlichen morphologischen Veränderungen, wie voll differenzierte, auf festem Medium gewachsene Zellen Dieses Papier bietet ein robustes und reproduzierbares Protokoll einer Methode, um Swarmer ce zu induzierenDie Differenzierung auf einer Agarfläche. Das Protokoll erzeugt eine Population von leicht zugänglichen Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellmikroskopie und die anschließende Analyse verfügbar sind. Darüber hinaus ermöglicht das Protokoll die Lokalisierungsstudien von fluoreszenzmarkierten Proteinen sowohl im Schwimmer als auch in den Swarmer-Zelltypen (Abschnitte 1, 2, 3, 4). Darüber hinaus beschreibt das Protokoll den nachfolgenden Workflow, wie man die erzeugten Daten aus Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten verarbeitet und analysiert, was eine demographische Analyse von Bakteriengesellschaften ermöglicht (Abschnitt 5).
Dieses Papier berichtet über eine Methode zur mikroskopischen Bildgebung von V. parahaemolyticus swarmer Zellen, gefolgt von nachgeschalteten Analysen, die dazu bestimmt sind, die subzelluläre Lokalisation und andere Merkmale der untersuchten fluoreszenzmarkierten Proteine zu lösen und zu quantifizieren. Obwohl für die Mikroskopie-Bildverarbeitung und -analyse 14 , 15 , 16 , 17</s…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.
Media components | |||
LB-medium | Roth | X968.3 | |
Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Additives | |||
L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hardware | |||
Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |