Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Nuotatore e cellule Swarmer
Summary
Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l'analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l'induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l'analisi delle immagini.
Abstract
La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all'interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un'analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell'analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l'analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.
Introduction
I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l'ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell'organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell'ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell'uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all'antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l'inibizione della divisione cellulare e l'induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori.
Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l'inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene 1 . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l'aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer 2 . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell'induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l'accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all'interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali <supClass = "xref"> 3 , 4 , 5 . Tuttavia, l'identità di tali acidi volatili rimane sconosciuta. Inoltre, è stato dimostrato che l'eccesso di disponibilità del calcio 6 e della limitazione di ferro 7 aumentano entrambe la differenziazione e la proliferazione di swarmer sulle superfici solide. Le cellule possono essere affamate per il ferro aggiungendo il composto 2,2'-Bipyridyl al mezzo di crescita, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione del swarmer 8 . I fattori noti per la regolazione della differenziazione sono ora implementati nella progettazione di un protocollo che riproducibilmente induce la differenziazione di V. parahaemolyticus in cellule swarmer e la loro proliferazione sulle superfici agariche solide.
V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi – processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all'interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido 8 . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l'analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento descrive un metodo per l'imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l'elaborazione e l'analisi di immagini microscopiche 14 , 15 , 16 , <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Max Planck.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
