Клетки нейронов мыши, культивируемые на многоэлектродных матрицах, проявляют увеличение ответа после электрической стимуляции. Этот протокол демонстрирует, как культивировать нейроны, как записывать активность, и как установить протокол для обучения сетей, чтобы реагировать на модели стимуляции.
Микроэлектродные массивы (MEA) могут использоваться для исследования токсичности лекарственных средств, конструктивных парадигм для персонализированной медицины нового поколения и изучения динамики сети в культурах нейронов. В отличие от более традиционных методов, таких как фиксация патчей, которые могут записывать активность только из одной ячейки, МЭС могут одновременно выполнять запись с нескольких сайтов в сети, не требуя сложной задачи размещения каждого электрода в отдельности. Более того, многочисленные конфигурации управления и стимуляции могут быть легко применены в одной и той же экспериментальной установке, что позволяет исследовать широкий диапазон динамики. Одной из ключевых динамик интереса к этим исследованиям in vitro было то, насколько культурные сети проявляют свойства, указывающие на обучение. Клетки нейронов мыши, культивируемые на МЭС, проявляют увеличение ответа после тренировки, вызванной электрической стимуляцией. Этот протокол демонстрирует, как культивировать нейронные клетки на МЭС; Успешно реШнур из более чем 95% покрытых блюд; Разработать протокол для обучения сетей в ответ на модели стимуляции; И сортировать, строить график и интерпретировать результаты таких экспериментов. Показана возможность использования запатентованной системы для стимуляции и регистрации нейронных культур. Программные пакеты также используются для сортировки нейронов. Пользовательский графический интерфейс пользователя используется для визуализации постиндустриальных гистограмм времени, интервалов между пакетами и длительности всплесков, а также для сравнения клеточного ответа на стимуляцию до и после протокола обучения. Наконец, обсуждаются репрезентативные результаты и будущие направления этого исследования.
Микроэлектродные массивы (MEAs) могут использоваться для исследования токсичности лекарственных средств, конструктивных парадигм для персонализированной медицины нового поколения и исследования динамики сети в культурах нейронов 1 . В отличие от более традиционных методов, таких как фиксация патчей, которые могут регистрировать активность только из одной клетки, или полевая запись со стеклянной пипеткой, которая может регистрировать внеклеточные ответы от нейронов, окружающих электрод, в одном месте – МЭС могут одновременно Запись с нескольких сайтов в культуре клеток, не требуя трудной задачи размещения каждого электрода в отдельности. Это позволяет изучать динамические взаимодействия между группами клеток, которые образуют сеть внутри этой культуры. Кроме того, эффекты электрической стимуляции на схемах сетевого зажигания 2 , 3 , 4 , 5 и управление сетью 6 </ Sup> в культурах нейронов хорошо документированы, и многочисленные конфигурации электростимуляции и контроля могут быть легко применены в рамках одной и той же экспериментальной установки, что позволяет исследовать широкий диапазон пространственно-временной динамики.
Одна из ключевых динамик интереса к этим исследованиям in vitro заключалась в том, насколько культурные сети проявляют свойства, указывающие на обучение 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Лаборатория Peixoto ранее изучала эффекты высокочастотных обучающих сигналов, как описано в Ruaro et al. 14 , в сетях мышиных нейронов, нанесенных на микроэлектродные массивы 15 . В этих экспериментах сети демонстрировали увеличение числа повторных ответовВызванное электростимуляцией. Повышенный ответ рассматривался как форма обучения через распознавание стимула, посредством чего сети последовательно реагировали на изменение стимула после применения специального протокола стимуляции ( то есть тренировки).
Этот протокол демонстрирует, как культивировать нейронные клетки на МЭС, успешно регистрировать из более чем 95% покрытых блюд, создать протокол для обучения сетей, чтобы реагировать на модели стимуляции, сортировать отдельные единицы активности, строить гистограммы и интерпретировать результаты из Такие эксперименты. Продемонстрирована возможность использования собственной системы (см. Таблицу материалов ) для стимуляции и регистрации нейронных культур, а также применения пакетов программного обеспечения (см. Таблицу материалов ) для сортировки нейронных единиц. Пользовательский графический интерфейс пользователя (см. Таблицу материалов ) используется для визуализации post-sВременные гистограммы времени, интервалы между пакетами и длительность пакета, а также сравнить клеточный ответ с стимуляцией до и после протокола обучения.
Шаги, изложенные в этом протоколе, предоставляют достаточно подробные сведения для новичка, чтобы он мог размещать свои собственные культуры нейронов на МЭС и записывать сетевую активность. Этот протокол поможет гарантировать, что культуры прилипают должным образом, образуя слой ковра клеток над электродными решетками, и остаются здоровыми и не загрязняющими в течение нескольких месяцев.
Хотя лучше всего придерживаться всех частей протокола, на протяжении всего процесса есть шаги, которые имеют решающее значение для успешного результата. Использование асептической техники на протяжении всего процесса является обязательным условием для предотвращения заражения культур. Новые МПС должны быть сделаны гидрофильными, как описано в протоколе, иначе это приведет к плохой клеточной адгезии. Избегая резкой пипетирования и образования пузырьков воздуха во время диссоциации, вы уменьшите количество поврежденных клеток и получите более высокий и более здоровый урожай. Переключение с DMEM 5/5 на DMEM + после первогоКормление также важно. DMEM 5/5 содержит лошадиную сыворотку, которая заставит глиальные клетки доминировать в культуре при непрерывном использовании и приведет к низкой активности нейронов, хотя культуры будут выглядеть здоровыми 17 . Кормление культур по расписанию и поддержание их в надлежащих условиях инкубации также имеет решающее значение.
Покрытие клеточных культур на МЭС включает в себя много переменных, которые могут привести к результатам, которые не являются оптимальными. Хотя цель – идеальный «ковер» ячеек, отказ от упомянутых выше критических шагов приведет к плохому созреванию клеток или загрязнению. Плохая клеточная адгезия, которая отличается от плохой созревания клеток, также вызывает беспокойство. Это может быть вызвано несколькими факторами, в том числе плохой подготовкой МЭА перед нанесением покрытий или использованием старой среды. Если старая среда, содержащая стабилизированную форму L-глутамина и бессывороточную добавку для культуры нервных клеток (см. Таблицу материалов), Клетки первоначально придерживаются, но затем уплывают примерно через две недели. Если бактериальная контаминация является постоянной проблемой, к среде можно добавить антибиотик, такой как ампициллин или пен-стреп. Есть также фунгициды, доступные для лечения грибкового загрязнения. Это некоторые из наиболее распространенных переменных, которые могут повлиять на результаты культур. Есть много других, которые будут встречаться только после времени и опыта.
По сравнению с использованием стеклянных микроэлектродов этот метод отлично подходит для изучения динамики сети и фармакологических реакций. Это позволяет использовать множество различных пространственно-временных шаблонов стимуляции и позволяет регистрировать реакции нейронов сразу из нескольких областей. Предыдущие группы продемонстрировали интересные результаты, используя протоколы, аналогичные описанным здесь 18 . Поскольку культуры сохраняются в течение недель или месяцев и могут быть повторно использованы одни и те же культуры, этот метод также являетсяLlows для нескольких экспериментов с течением времени в одной и той же сети.
Тем не менее, существуют ограничения в этом методе. МПС являются неинвазивными. Поэтому они могут регистрировать внеклеточную активность, в отличие от фиксации патчей или внутриклеточной записи с помощью пипеток. Более того, поскольку каждый электрод в массиве покрыт несколькими ячейками, невозможно разрешить активность одного нейрона. И наоборот, поскольку они являются культурами in vitro , они не могут полностью воспроизвести структурные свойства сетей в головном мозге. Кроме того, активность может регистрироваться только в течение менее 30 мин за один раз, без какого-либо механизма, обеспечивающего атмосферу СО 2, чтобы клетки сохраняли свой рН-баланс.
После того, как этот метод освоен, можно изучить фармакологические манипуляции с электрической стимуляцией или без нее. Новые протоколы для исследования обучения и формирования памяти в нейронных сетях также могут быть спроектированы и протестированы вместе с pРотоки для сетей гиппокампа или спинного мозга. Ранее были опубликованы протоколы для стимулирования и обучения сетей, некоторые из которых были дополнительно развиты в протоколы in vivo , такие как «селективная адаптация», предложенная Eytan et al. 19 . Были протестированы несколько протоколов. Однако только результаты модификации процедуры столбняка, предложенной Руаро в 2005 году, представлены здесь 14 , 20 .
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась грантом Национального научного фонда CMMI-1300007. Мы хотели бы поблагодарить предыдущих членов лаборатории, которые помогли в разработке этих протоколов и поддержании культуры на протяжении более пяти лет в Университете Джорджа Мейсона: д-р Джозеф Дж. Панкрацио, д-р Хамид Чарккар, д-р Гретхен Кнаак , Д-ром Францем Гамильтоном, Майклом Макерой и Робертом Грэмом.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |