Células neuronais de rato cultivadas em matrizes de múltiplos eléctrodos apresentam um aumento na resposta após estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar neurônios, como registrar a atividade, e como estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação.
Micro-eletrodo arrays (MEAs) pode ser usado para investigar toxicidade de drogas, paradigmas de design para a próxima geração de medicina personalizada, e estudar dinâmica de rede em culturas neuronais. Em contraste com os métodos mais tradicionais, como o patch-clamping, que só pode registrar a atividade de uma única célula, os MEAs podem gravar simultaneamente a partir de múltiplos sites em uma rede, sem exigir a árdua tarefa de colocar cada eletrodo individualmente. Além disso, numerosas configurações de controle e estimulação podem ser facilmente aplicadas dentro da mesma configuração experimental, permitindo uma ampla gama de dinâmicas a serem exploradas. Uma das principais dinâmicas de interesse nestes estudos in vitro foi a extensão em que as redes cultivadas exibem propriedades indicativas de aprendizagem. Células neuronais de rato cultivadas em MEAs exibem um aumento na resposta após o treino induzido por estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar células neuronais em MEAs; Com sucessoMais de 95% dos pratos banhados; Estabelecer um protocolo para capacitar as redes a responder aos padrões de estimulação; E classificar, plotar e interpretar os resultados de tais experimentos. O uso de um sistema proprietário para estimular e registrar culturas neuronais é demonstrado. Pacotes de software também são usados para classificar unidades neuronais. Uma interface de usuário gráfica personalizada é usada para visualizar histogramas de tempo pós-estímulo, intervalos entre rajadas e duração de rajada, assim como comparar a resposta celular à estimulação antes e depois de um protocolo de treinamento. Finalmente, são discutidos os resultados representativos e as direções futuras deste esforço de pesquisa.
Micro-eletrodo arrays (MEAs) pode ser usado para investigar toxicidade de drogas, paradigmas de design para a próxima geração de medicina personalizada, e estudar dinâmica de rede em culturas neuronais 1 . Em contraste com métodos mais tradicionais – como o patch-clamping, que só pode registrar a atividade de uma única célula, ou gravação de campo com uma pipeta de vidro, que pode registrar respostas extracelulares dos neurônios que cercam o eletrodo em um único local – MEAs pode simultaneamente Registro de vários locais em uma cultura de células sem exigir a árdua tarefa de colocar cada eletrodo individualmente. Isso permite o estudo das interações dinâmicas entre grupos de células que formam uma rede dentro dessa cultura. Além disso, os efeitos da estimulação elétrica em padrões de disparo de rede 2 , 3 , 4 , 5 e controle de rede 6 </ Sup> em culturas neuronais têm sido bem documentadas, e numerosas configurações de estimulação elétrica e controles podem ser facilmente aplicados dentro da mesma configuração experimental, permitindo uma ampla gama de dinâmicas espaço-temporais a serem exploradas.
Uma das principais dinâmicas de interesse nesses estudos in vitro foi a extensão em que as redes cultivadas exibem propriedades indicativas de aprendizagem 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . O Laboratório Peixoto examinou previamente os efeitos dos sinais de treino de alta frequência, tal como descrito em Ruaro et al. 14 , em redes de neurônios de camundongos banhados em matrizes de microeletrodos 15 . Nestas experiências, as redes apresentaram um aumento na respostaG induzido por estimulação elétrica. A resposta aumentada foi considerada uma forma de aprendizagem através do reconhecimento de estímulo, pelo que as redes responderam de forma consistente a uma mudança no estímulo após a aplicação de um protocolo específico de estimulação ( ie, treinamento).
Este protocolo demonstra como cultivar células neuronais em MEAs, registrar com sucesso mais de 95% dos pratos banhados, estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação, classificar atividade de unidade única, plotar histogramas e interpretar os resultados de Experiências. O uso de um sistema proprietário (veja a Tabela de Materiais ) para a estimulação e registro de culturas neuronais é demonstrado, bem como a aplicação de pacotes de software (veja a Tabela de Materiais ) para classificar unidades neuronais . Uma interface gráfica personalizada (veja a Tabela de Materiais ) é usada para visualizar asTempo timulus histogramas, inter-burst intervalos, e burst duração, bem como para comparar a resposta celular para a estimulação antes e após um protocolo de treinamento.
As etapas descritas neste protocolo fornecem detalhes suficientes para que o iniciante aplique suas próprias culturas neuronais nos MEAs e registre a atividade da rede. Este protocolo ajudará a garantir que as culturas aderem adequadamente, formando uma camada de carpete de células sobre as matrizes de eletrodos, e permanecer saudável e livre de contaminantes por meses.
Embora seja melhor aderir a todas as partes do protocolo, existem etapas ao longo do processo que são fundamentais para o resultado bem sucedido. O uso de técnica asséptica ao longo de todo o processo é imperativo para evitar que as culturas se contaminem. Os novos MEAs devem ser hidrófilos, como descrito no protocolo, ou então resultará numa adesão celular fraca. Evitar pipetting áspero ea formação de bolhas de ar durante a dissociação reduzirá o número de pilhas danificadas chapeadas e conduzirá a um rendimento mais elevado e mais saudável. Comutação de DMEM 5/5 para DMEM + após a primeiraAlimentação também é importante. O DMEM 5/5 contém soro de cavalo, o que fará com que as células gliais dominem a cultura se usadas continuamente e resultarão em baixa atividade neuronal, embora as culturas pareçam saudáveis 17 . Alimentar as culturas conforme programado e mantê-las em condições de incubação adequadas também é crucial.
Plating culturas de células em MEAs envolve muitas variáveis que podem levar a menos do que os melhores resultados. Embora a meta seja um "tapete" perfeito de células, a incapacidade de resolver os passos críticos mencionados acima resultará em fraca maturação de células ou em contaminação. A baixa aderência celular, que é diferente da má maturação celular, também é uma preocupação. Isto pode ser causado por vários fatores, incluindo preparação de MEA pobres antes de chapeamento ou o uso de meio velho. Se um meio antigo contendo uma forma estabilizada de L-glutamina e um suplemento sem soro para cultura de células neurais (ver Tabela de Materiais), As células inicialmente aderem mas flutuam depois de cerca de duas semanas. Se a contaminação bacteriana é um problema persistente, um antibiótico, tal como ampicilina ou pen-strep, pode ser adicionado ao meio. Existem também fungicidas disponíveis para tratar a contaminação por fungos. Estas são algumas das variáveis mais comuns que podem afetar o resultado das culturas. Há muitos outros que só serão encontrados depois do tempo e da experiência.
Em comparação com o uso de microeletrodos de vidro, esta técnica é excelente para estudar dinâmica de rede e respostas farmacológicas. Permite o uso de muitos padrões de estimulação espaço-temporais diferentes e permite a gravação de respostas neuronais de múltiplas áreas ao mesmo tempo. Os grupos anteriores demonstraram resultados interessantes usando protocolos semelhantes aos aqui descritos 18 . Como as culturas duram por semanas ou meses e as mesmas culturas podem ser reutilizadas, esta técnicaPara várias experiências ao longo do tempo na mesma rede.
No entanto, existem limitações a esta técnica. Os MEAs não são invasivos. Portanto, eles só podem registrar atividade extracelular, em oposição ao patch-clamping ou gravação intracelular com pipetas. Além disso, uma vez que cada eléctrodo numa matriz é coberto por várias células, não é possível resolver a actividade de um único neurónio. Por outro lado, por serem culturas in vitro , não conseguem reproduzir integralmente as propriedades estruturais das redes no cérebro. Também, a actividade só pode ser registada durante menos de 30 min de cada vez sem algum mecanismo proporcionando uma atmosfera de CO 2 para as células manterem o seu equilíbrio de pH.
Uma vez que esta técnica é dominada, manipulações farmacológicas com ou sem estimulação elétrica podem ser exploradas. Novos protocolos para sondar a aprendizagem ea formação de memória em redes neuronais também podem ser projetados e testados, juntamente com pRotocolos para redes do hipocampo ou da medula espinhal. Protocolos para estimulação e treinamento de redes foram publicados anteriormente, e alguns deles foram desenvolvidos em protocolos in vivo , como a "adaptação seletiva" proposta por Eytan et al. 19 . Vários protocolos foram testados. No entanto, apenas os resultados de uma modificação do procedimento de tétano proposto por Ruaro em 2005 são apresentados aqui 14 , 20 .
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation conceder CMMI-1300007. Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório anterior, que ajudaram com o desenho desses protocolos e com a manutenção das culturas por mais de cinco anos na Universidade George Mason: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera e Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |