Le cellule neuronali del mouse coltivate su matrici multi-elettrodi mostrano un aumento della risposta dopo stimolazione elettrica. Questo protocollo illustra come coltivare i neuroni, come registrare l'attività e come stabilire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione.
Le matrici di microelettrodi (MEAs) possono essere utilizzate per studiare la tossicità di farmaci, i paradigmi di progettazione per la medicina personalizzata di nuova generazione e la dinamica di rete di studio nelle culture neuronali. Contrariamente a metodi più tradizionali, quali la patch-clamping, che possono registrare solo attività da una singola cella, i MEA possono registrare contemporaneamente da più siti in una rete, senza richiedere l'arduo compito di posizionare ciascun elettrodo singolarmente. Inoltre, numerose configurazioni di controllo e stimolazione possono essere facilmente applicate nella stessa configurazione sperimentale, consentendo di esplorare un'ampia gamma di dinamiche. Una delle dinamiche chiave di interesse in questi studi in vitro è stata la misura in cui le reti coltivate mostrano proprietà che indicano l'apprendimento. Le cellule neuronali del mouse coltivate in MEA mostrano un aumento della risposta dopo la formazione indotta dalla stimolazione elettrica. Questo protocollo illustra come coltivare le cellule neuronali sulle MEA; Riuscito con successoCavo da oltre il 95% dei piatti placcati; Istituire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione; E ordinare, tracciare e interpretare i risultati di tali esperimenti. È stato dimostrato l'uso di un sistema proprietario per stimolare e registrare culture neuronali. I pacchetti software vengono utilizzati anche per ordinare le unità neuronali. Un'interfaccia utente grafica personalizzata viene utilizzata per visualizzare gli istogrammi del tempo post-stimolo, gli intervalli interpolati e la durata di scoppio, nonché confrontare la risposta cellulare alla stimolazione prima e dopo un protocollo di allenamento. Infine, vengono discussi risultati rappresentativi e indicazioni future di questo sforzo di ricerca.
Le matrici di microelettrodi (MEAs) possono essere utilizzate per indagare la tossicità dei farmaci, i paradigmi di progettazione per la medicina personalizzata di nuova generazione e la dinamica di rete di studio nelle culture neuronali 1 . Contrariamente a metodi più tradizionali, come ad esempio il bloccaggio delle patch, che può registrare solo attività da una singola cella o registrazione in campo con una pipetta di vetro, in grado di registrare risposte extracellulari dai neuroni che circondano l'elettrodo in un unico sito-MEAs possono simultaneamente Registrare da siti multipli in una coltura cellulare senza richiedere l'arduo compito di posizionare ciascun elettrodo individualmente. Ciò consente di studiare le interazioni dinamiche tra gruppi di cellule che formano una rete all'interno di quella cultura. Inoltre, gli effetti della stimolazione elettrica sugli schemi di cottura di rete 2 , 3 , 4 , 5 e il controllo di rete 6 </ Sup> nelle culture neuronali sono state ben documentate e numerose configurazioni di stimolazione elettrica e controlli possono essere facilmente applicati all'interno della stessa configurazione sperimentale, consentendo di esplorare un'ampia gamma di dinamiche spazio-temporali.
Una delle dinamiche chiave di interesse in questi studi in vitro è stata la misura in cui le reti coltivate mostrano proprietà che indicano l'apprendimento 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Il Peixoto Lab ha esaminato in precedenza gli effetti dei segnali di allenamento ad alta frequenza, come descritto in Ruaro et al. 14 , sulle reti dei neuroni del mouse placcati sugli array di microelettrodi 15 . In questi esperimenti, le reti hanno mostrato un aumento della risposta in seguitoG allenamento indotto dalla stimolazione elettrica. L'aumento della risposta è stata considerata una forma di apprendimento tramite il riconoscimento dello stimolo, in base alle quali le reti hanno risposto in modo coerente a una modifica dello stimolo dopo l'applicazione di un protocollo di stimolazione specifica ( es .
Questo protocollo dimostra come coltivare le cellule neuronali in MEA, registrare con successo da oltre il 95% dei piatti placcati, stabilire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione, ordinare l'attività a singola unità, istogrammi della trama e interpretare i risultati Tali esperimenti. È stato dimostrato l'uso di un sistema proprietario (vedi tabella dei materiali ) per la stimolazione e la registrazione delle culture neuronali, nonché l'applicazione di pacchetti software (vedi tabella dei materiali ) per ordinare le unità neuronali . Un'interfaccia utente grafica personalizzata (vedere la tabella dei materiali ) viene utilizzata per visualizzare i post-sGli istogrammi temporali di timulus, gli intervalli interpolati e la durata di scoppio, nonché di confrontare la risposta cellulare alla stimolazione prima e dopo un protocollo di allenamento.
I passi descritti in questo protocollo forniscono sufficienti dettagli per il principiante per piegare le proprie culture neuronali sulle MEA e per registrare l'attività di rete. Questo protocollo contribuirà a garantire che le culture aderiscano correttamente, formando uno strato di cellule di moquette sulle matrici degli elettrodi e rimangono sani e privi di contaminazione per mesi.
Anche se è meglio aderire a tutte le parti del protocollo, ci sono passaggi per tutto il processo che sono fondamentali per l'esito positivo. L'uso della tecnica asettica in tutto il processo è imperativo per impedire che le culture diventino contaminate. I nuovi MEA devono essere resi idrofili, come descritto nel protocollo, altrimenti si verificherà un'adeguata adesione cellulare. Evitando pipettature dure e la formazione di bolle d'aria durante la dissociazione ridurrà il numero di cellule danneggiate e porterà ad una resa più elevata e più sana. Passaggio da DMEM 5/5 a DMEM + dopo il primoL'alimentazione è anche importante. DMEM 5/5 contiene il siero di cavallo, che causerà le cellule gliali a dominare la cultura se usato continuamente e provocherà una cattiva attività neuronale, anche se le culture appariranno sane 17 . Nutrire le culture come previsto e mantenerle in condizioni di incubazione adeguate è anche cruciale.
Le colture di cellule di placcatura su MEA implicano molte variabili che possono portare a risultati inferiori al massimo. Sebbene l'obiettivo sia un "tappeto" perfetto delle cellule, l'insuccesso di affrontare i passaggi critici sopra menzionati comporterà una maturazione della cellula povera o una contaminazione. Anche la cattiva adesione cellulare, diversa dalla maturazione della cellula povera, è anche una preoccupazione. Ciò può essere causato da diversi fattori, tra cui la preparazione povera di MEA prima della placcatura o dell'utilizzo di vecchi supporti. Se vecchio mezzo contenente una forma stabilizzata di L-glutamina e senza supplemento di siero per la coltura di cellule neurali (cfr), Le cellule inizialmente si aderiscono, ma poi galleggiano dopo circa due settimane. Se la contaminazione batterica è un problema persistente, un antibiotico, ad esempio ampicillina o pen-strep, può essere aggiunto al mezzo. Ci sono anche fungicidi disponibili per trattare la contaminazione fungina. Queste sono alcune delle variabili più comuni che possono influenzare l'esito delle culture. Ci sono molti altri che verranno incontrati solo dopo il tempo e l'esperienza.
In confronto all'uso di microelettrodi di vetro, questa tecnica è eccellente per studiare le dinamiche di rete e le risposte farmacologiche. Consente l'uso di molti differenti modelli di stimolazione spaziometrica e temporale e consente la registrazione delle risposte neuronali da più aree contemporaneamente. I gruppi precedenti hanno dimostrato risultati interessanti utilizzando protocolli simili a quelli descritti qui 18 . Poiché le culture durano per settimane o mesi e le stesse culture possono essere riutilizzate, questa tecnica è anche unaPer esperimenti multipli nel tempo sulla stessa rete.
Tuttavia, esistono limitazioni a questa tecnica. I MEA sono non invasivi. Pertanto, possono registrare solo attività extracellulare, in contrasto con la registrazione delle patch o la registrazione intracellulare con pipette. Inoltre, poiché ogni elettrodo in una matrice è coperto da diverse cellule, non è possibile risolvere l'attività di un singolo neurone. Al contrario, perché queste sono culture in vitro , non possono riprodurre completamente le proprietà strutturali delle reti nel cervello. Inoltre, l'attività può essere registrata solo per meno di 30 minuti alla volta senza un meccanismo che fornisce un'atmosfera di CO 2 per le cellule per mantenere il loro equilibrio del pH.
Una volta acquisita questa tecnica, possono essere esplorate manipolazioni farmacologiche con o senza stimolazione elettrica. Possono anche essere progettati e testati nuovi protocolli per sondare l'apprendimento e la formazione della memoria nelle reti neuronali, insieme a pRotocoli per reti ippocampali o midollo spinale. I protocolli per la stimolazione e la formazione delle reti sono stati precedentemente pubblicati e alcuni di questi sono stati ulteriormente sviluppati in protocolli in vivo , come ad esempio l'adattamento selettivo proposto da Eytan et al. 19 . Sono stati testati diversi protocolli. Tuttavia, solo i risultati di una modifica alla procedura del tetano proposto da Ruaro nel 2005 sono presentati qui 14 , 20 .
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione della National Science Foundation CMMI-1300007. Vorremmo riconoscere ai membri del laboratorio che hanno contribuito alla progettazione di questi protocolli e al mantenimento delle culture da oltre cinque anni presso l'Università George Mason: il Dr. Joseph J. Pancrazio, il Dr. Hamid Charkhkar, il Dr. Gretchen Knaack , Il dottor Franz Hamilton, Michael Maquera e Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |