Muisneuronale cellen die op multi-elektrode arrays worden gekweekt, tonen een toename van de respons na elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronen kunt cultiveren, hoe u activiteiten opneemt en hoe u een protocol kunt opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen.
Micro-elektrode arrays (MEA's) kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken, ontwerpparadigma's voor de volgende generatie gepersonaliseerde medicijnen te onderzoeken en de netwerkdynamiek in neuronale culturen te bestuderen. In tegenstelling tot meer traditionele methoden, zoals patch-klemmen, die alleen de activiteit van een enkele cel kunnen opnemen, kunnen MEA's tegelijkertijd op meerdere locaties in een netwerk opnemen, zonder dat het nodig is om elke elektrode afzonderlijk te plaatsen. Bovendien kunnen talrijke controle- en stimulatieconfiguraties gemakkelijk worden toegepast binnen dezelfde experimentele opstelling, waardoor een breed scala aan dynamieken kan worden onderzocht. Een van de belangrijkste dynamieken van belangstelling in deze in vitro studies is in hoeverre gekweekte netwerken eigenschappen aanwijzen die indicatief zijn voor het leren. Muis-neuronale cellen die op MEA's zijn gekweekt, tonen een toename van de respons na training die wordt geïnduceerd door elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronale cellen op MEA's kunt cultiveren; Succesvol reKoord van meer dan 95% van de platte schotels; Een protocol opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen; En sorteer, plot en interpreteer de resultaten van dergelijke experimenten. Het gebruik van een eigen systeem voor het stimuleren en registreren van neuronale culturen wordt aangetoond. Softwarepakketten worden ook gebruikt om neuroneenheden te sorteren. Een custom-designed grafische gebruikersinterface wordt gebruikt om post-stimulus tijd histogrammen, inter-burst intervallen en burst duration te visualiseren, evenals de cellulaire respons op stimulatie voor en na een trainingsprotocol te vergelijken. Tenslotte worden representatieve resultaten en toekomstige aanwijzingen van deze onderzoeksinspanning besproken.
Micro-elektrode arrays (MEA's) kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken, ontwerpparadigma's voor de volgende generatie gepersonaliseerde medicijnen te onderzoeken en de netwerkdynamiek in neuronale culturen te bestuderen 1 . In tegenstelling tot meer traditionele methoden, zoals patch-klemmen, die alleen de activiteit van een enkele cel kunnen registreren of veldopname met een glaspipet, die extracellulaire reacties opneemt van de neuronen die de elektrode omringen op een enkele plaats, kunnen MEA tegelijkertijd Opnemen van meerdere plaatsen in een celcultuur zonder dat de moeilijke taak nodig is om elke elektrode afzonderlijk te plaatsen. Dit zorgt voor de studie van de dynamische interacties tussen groepen cellen die een netwerk vormen binnen die cultuur. Bovendien zijn de effecten van elektrische stimulatie op netwerkbrandpatronen 2 , 3 , 4 , 5 en netwerkcontrole 6 </ Sup> in neuronale culturen zijn goed gedocumenteerd en talrijke configuraties van elektrische stimulatie en controles kunnen gemakkelijk worden toegepast binnen dezelfde experimentele opstelling, waardoor een breed scala aan spatio-temporale dynamiek kan worden onderzocht.
Een van de belangrijkste dynamieken van belangstelling in deze in vitro studies is in hoeverre gekweekte netwerken eigenschappen tonen die indicatief zijn voor het leren van 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . De Peixoto Lab heeft eerder de effecten van hoogfrequente trainingssignalen onderzocht, zoals beschreven in Ruaro et al. 14 , op netwerken van muisneuronen geplateerd op micro-elektrode arrays 15 . In deze experimenten vertoonden netwerken een toename van de responsvolgordeG training geïnduceerd door elektrische stimulatie. De verhoogde respons werd beschouwd als een vorm van leren via stimulusherkenning, waarbij de netwerken op een consistente manier reageren op een verandering in stimulus na de toepassing van een specifiek stimulatieprogramma ( dat wil zeggen training).
Dit protocol demonstreert hoe u neuronale cellen op MEA's kunt cultiveren, succesvol opnemen van meer dan 95% van de platte schotels, een protocol opstellen om de netwerken op te leiden om stimuleringspatronen te reageren, de activiteit van een eenheid te plannen, histogrammen te plotten en de resultaten te interpreteren Dergelijke experimenten. Het gebruik van een eigen systeem (zie de Tabel van Materialen ) voor de stimulatie en opname van neuronale culturen wordt aangetoond, evenals de toepassing van softwarepakketten (zie de Tabel van Materialen ) om neuroneenheden te sorteren. Een custom-designed grafische gebruikersinterface (zie de tabel van materialen ) wordt gebruikt om post-s te visualiserenTimulus tijd histogrammen, inter-burst intervallen en burst duration, evenals het vergelijken van de cellulaire respons op stimulatie voor en na een trainingsprotocol.
De stappen die in dit protocol zijn beschreven, geven voldoende informatie voor de beginner om zijn / haar eigen neuronale culturen op MEA's te platen en om netwerkactiviteit op te nemen. Dit protocol zal helpen om ervoor te zorgen dat de culturen goed aansluiten, een tapijtlaag van cellen vormen over de elektrode-arrays, en gedurende enkele maanden gezond en verontreinigd blijven.
Hoewel het het beste is om aan alle delen van het protocol te voldoen, zijn er stappen in het proces die kritiek zijn op het succesvolle resultaat. Het gebruik van aseptische techniek door het gehele proces is essentieel om te voorkomen dat de culturen besmet raken. Nieuwe MEA's moeten hydrofiel worden gemaakt, zoals beschreven in het protocol, of anders zal een slechte celhechting ontstaan. Het vermijden van harde pipettering en de vorming van luchtbellen tijdens dissociatie zullen het aantal beschadigde cellen verminderen en zal leiden tot een hogere en gezondere opbrengst. Overschakelen van DMEM 5/5 naar DMEM + na de eersteVoeding is ook belangrijk. DMEM 5/5 bevat paardserum, waardoor glialcellen de cultuur zullen domineren als ze continu worden gebruikt en resulteren in slechte neuronale activiteit, hoewel de culturen gezond zullen blijken 17 . Voeding van de culturen zoals gepland en in goede incubatie omstandigheden te houden is ook van cruciaal belang.
Plating van celculturen op MEA's omvat veel variabelen die kunnen leiden tot minder dan optimale resultaten. Hoewel het doel een perfect "tapijt" van cellen is, zal het niet voldoen aan de bovengenoemde kritische stappen resulteren in slechte celmaturatie of in vervuiling. Slechte celhechting, die verschilt van arme celmaturatie, is ook een zorg. Dit kan worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder een slechte MEA-voorbereiding voorafgaand aan plating of het gebruik van oud medium. Als oud medium dat een gestabiliseerde vorm van L-glutamine en serumvrij supplement voor neurale celcultuur bevat (zie Materialtabel) Wordt gebruikt, hechten de cellen aanvankelijk maar dan na ongeveer twee weken weg. Als bacteriële besmetting een aanhoudend probleem is, kan een antibioticum, zoals ampicilline of pen-streep, aan het medium worden toegevoegd. Er zijn ook fungiciden beschikbaar om schimmelinfectie te behandelen. Dit zijn enkele van de meest voorkomende variabelen die het resultaat van de culturen kunnen beïnvloeden. Er zijn veel anderen die alleen na tijd en ervaring worden geconfronteerd.
In vergelijking met het gebruik van glasmicro-elektroden is deze techniek uitstekend voor het bestuderen van netwerkdynamiek en farmacologische reacties. Het maakt het mogelijk om veel verschillende spatio-temporale stimulatiepatronen te gebruiken en zorgt tegelijk voor het opnemen van neuronale responsen uit meerdere gebieden. Vorige groepen hebben interessante resultaten laten zien met behulp van protocollen die vergelijkbaar zijn met die welke hier worden beschreven 18 . Aangezien de culturen voor weken of maanden duren en dezelfde culturen kunnen worden hergebruikt, deze techniek ook eenLijkt op meerdere experimenten in de loop der tijd op hetzelfde netwerk.
Er zijn echter beperkingen voor deze techniek. MEA's zijn niet-invasieve. Daarom kunnen ze alleen extracellulaire activiteit opnemen, in tegenstelling tot patch-klemmen of intracellulaire opname met pipetten. Bovendien, aangezien elke elektrode in een matrix door meerdere cellen is bedekt, is het niet mogelijk om de activiteit van een enkele neuron op te lossen. Omgekeerd, omdat deze in vitro culturen zijn, kunnen ze de structurele eigenschappen van netwerken in de hersenen niet volledig reproduceren. Ook kan de activiteit slechts minder dan 30 minuten per keer worden opgenomen, zonder dat er een mechanisme is dat een CO 2 -atmosfeer biedt voor de cellen om hun pH-balans te handhaven.
Zodra deze techniek wordt beheerd, kunnen farmacologische manipulaties met of zonder elektrische stimulatie worden onderzocht. Nieuwe protocollen om leer- en geheugenvorming in neuronale netwerken te onderzoeken kunnen ook worden ontworpen en getest, samen met pRotocolken voor hippocampale of ruggengraat netwerken. Protocollen voor het stimuleren en trainen van netwerken zijn eerder gepubliceerd, en sommige daarvan werden verder ontwikkeld tot in vivo protocollen, zoals de "selectieve aanpassing" die door Eytan et al werd voorgesteld . 19 . Verscheidene protocollen werden getest. Echter, alleen resultaten van een wijziging van de tetanusprocedure die Ruaro in 2005 voorstelde, worden hier 14 , 20 weergegeven.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie CMMI-1300007. We willen graag eerdere lableden, die hebben geholpen bij het ontwerpen van deze protocollen, en met de instandhouding van de culturen al meer dan vijf jaar bij de George Mason University hebben geholpen: Dr. J. J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera, en Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |