Les cellules neuronales de la souris cultivées sur des matrices multi-électrodes affichent une augmentation de la réponse suite à une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment culture des neurones, comment enregistrer l'activité et comment établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation.
Les tableaux de micro-électrodes (MEA) peuvent être utilisés pour étudier la toxicité du médicament, les paradigmes de conception pour la médecine personnalisée de prochaine génération et étudier la dynamique du réseau dans les cultures neuronales. Contrairement aux méthodes plus traditionnelles, comme le patch-clamping, qui ne peuvent enregistrer que l'activité à partir d'une seule cellule, les MEA peuvent enregistrer simultanément à partir de plusieurs sites dans un réseau, sans nécessiter la tâche ardue de placer chaque électrode individuellement. En outre, de nombreuses configurations de contrôle et de stimulation peuvent être facilement appliquées dans la même configuration expérimentale, ce qui permet d'explorer une large gamme de dynamiques. L'une des principales dynamiques d'intérêt pour ces études in vitro a été la mesure dans laquelle les réseaux cultivés affichent des propriétés indicatives de l'apprentissage. Les cellules neuronales de la souris cultivées sur les AME affichent une augmentation de la réponse suite à une formation induite par une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment faire la culture des cellules neuronales sur les AME; Re re reCordon de plus de 95% des plats plaqués; Établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation; Et trier, tracer et interpréter les résultats de ces expériences. L'utilisation d'un système exclusif pour stimuler et enregistrer des cultures neuronales est démontrée. Les packages logiciels sont également utilisés pour trier les unités neuronales. Une interface utilisateur graphique personnalisée est utilisée pour visualiser les histogrammes temporels post-stimulus, les intervalles inter-éclatement et la durée de l'éclatement, ainsi que pour comparer la réponse cellulaire à la stimulation avant et après un protocole de formation. Enfin, les résultats représentatifs et les orientations futures de cet effort de recherche sont discutés.
Les tableaux de microélectrolyse (MEA) peuvent être utilisés pour étudier la toxicité du médicament, les paradigmes de conception pour la médecine personnalisée de prochaine génération et étudier la dynamique du réseau dans les cultures neuronales 1 . Contrairement aux méthodes plus traditionnelles, telles que le patch-clamping, qui ne peuvent enregistrer que l'activité à partir d'une seule cellule, ou enregistrer sur le terrain avec une pipette en verre, qui peut enregistrer des réponses extracellulaires des neurones entourant l'électrode sur un seul site, les MEA peuvent simultanément Enregistrer à partir de sites multiples dans une culture cellulaire sans nécessiter la tâche ardue de placer chaque électrode individuellement. Cela permet d'étudier les interactions dynamiques entre les groupes de cellules qui forment un réseau au sein de cette culture. En outre, les effets de la stimulation électrique sur les modèles de tir de réseau 2 , 3 , 4 , 5 et le contrôle du réseau 6 </ Sup> dans les cultures neuronales ont été bien documentées, et de nombreuses configurations de stimulation électrique et de contrôles peuvent être facilement appliquées dans la même configuration expérimentale, ce qui permet d'explorer une large gamme de dynamiques spatio-temporelles.
L'une des principales dynamiques d'intérêt pour ces études in vitro a été la mesure dans laquelle les réseaux cultivés affichent des propriétés indicatives d'apprentissage 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Le Laboratoire Peixoto a précédemment examiné les effets des signaux de formation à haute fréquence, comme décrit dans Ruaro et al. 14 , sur des réseaux de neurones de souris plaqués sur des tableaux de microélectrodes 15 . Dans ces expériences, les réseaux affichent une augmentation de la réponse suiteG formation induite par la stimulation électrique. La réponse accrue a été considérée comme une forme d'apprentissage grâce à la reconnaissance de stimulus, grâce à laquelle les réseaux ont répondu de manière cohérente à un changement de stimulus après l'application d'un protocole de stimulation spécifique ( c.-à-d. Formation).
Ce protocole démontre comment cultiver les cellules neuronales sur les AME, enregistrer avec succès sur plus de 95% des plats plaqués, établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation, trier l'activité à une unité, tracer des histogrammes et interpréter les résultats de De telles expériences. L'utilisation d'un système exclusif (voir la Table des matières ) pour la stimulation et l'enregistrement des cultures neuronales est démontrée, ainsi que l'application de logiciels (voir la Table des matériaux ) pour trier les unités neuronales . Une interface utilisateur graphique personnalisée (voir la table des matières ) sert à visualiser les post-sLes histogrammes de temps timulus, les intervalles inter-éclatement et la durée de l'éclatement, ainsi que pour comparer la réponse cellulaire à la stimulation avant et après un protocole de formation.
Les étapes décrites dans ce protocole fournissent suffisamment de détails pour que le débutant prenne ses propres cultures neuronales sur les AME et enregistre l'activité du réseau. Ce protocole aidera à s'assurer que les cultures adhèrent correctement, en formant une couche de tapis sur les matrices des électrodes et restent en bonne santé et sans contaminants pendant des mois.
Bien qu'il soit préférable d'adhérer à toutes les parties du protocole, il existe des étapes tout au long du processus qui sont essentielles à la réussite. L'utilisation de la technique aseptique tout au long du processus est impératif pour empêcher les cultures de se contaminer. Les nouveaux MEA doivent être hydrophiles, comme décrit dans le protocole, ou bien une faible adhésion cellulaire résultera. L'évitement des pipettes sévères et la formation de bulles d'air pendant la dissociation réduiront le nombre de cellules endommagées et conduiront à un rendement plus élevé et plus sain. Passer du DMEM 5/5 au DMEM + après le premierL'alimentation est également importante. DMEM 5/5 contient du sérum de cheval, ce qui entraînera des cellules gliales à dominer la culture si elles sont utilisées en continu et entraîneront une activité neuronale médiocre, même si les cultures apparaîtront en bonne santé 17 . L'alimentation des cultures comme prévu et leur maintien dans des conditions d'incubation appropriées est également crucial.
Le plaquage des cultures de cellules sur les AME implique de nombreuses variables qui peuvent conduire à des résultats moins optimistes. Bien que l'objectif soit un "tapis" parfait des cellules, le fait de ne pas aborder les étapes critiques mentionnées ci-dessus entraînera une mauvaise maturation cellulaire ou une contamination. Une mauvaise adhésion cellulaire, qui est différente de la mauvaise maturation cellulaire, est également une préoccupation. Cela peut être causé par plusieurs facteurs, y compris une mauvaise préparation des MEA avant le placage ou l'utilisation d'un ancien milieu. Si un ancien milieu contenant une forme stabilisée de L-glutamine et un complément sans sérum pour la culture de cellules neurales (voir Tableau des matériaux) Est utilisé, les cellules adhèrent initialement mais ensuite flottent après environ deux semaines. Si la contamination bactérienne est un problème persistant, un antibiotique, tel que l'ampicilline ou la streptocoque, peut être ajouté au milieu. Il existe également des fongicides disponibles pour traiter la contamination fongique. Voici quelques-unes des variables les plus communes qui peuvent affecter les résultats des cultures. Il y en a beaucoup d'autres qui ne seront rencontrés qu'après de temps et d'expérience.
Par rapport à l'utilisation de microélectrodes en verre, cette technique est excellente pour étudier la dynamique du réseau et les réponses pharmacologiques. Il permet d'utiliser de nombreux motifs de stimulation spatio-temporels différents et permet l'enregistrement de réponses neuronales à partir de plusieurs zones à la fois. Les groupes précédents ont démontré des résultats intéressants en utilisant des protocoles similaires à ceux décrits ici 18 . Comme les cultures durent des semaines ou des mois et que les mêmes cultures peuvent être réutilisées, cette technique est aussi unePour des expériences multiples au fil du temps sur le même réseau.
Cependant, il existe des limites à cette technique. Les AME ne sont pas invasifs. Par conséquent, ils ne peuvent enregistrer que l'activité extracellulaire, par opposition à un clampage ou un enregistrement intracellulaire avec des pipettes. En outre, comme chaque électrode dans un réseau est couverte par plusieurs cellules, il n'est pas possible de résoudre l'activité d'un seul neurone. À l'inverse, parce que ce sont des cultures in vitro , ils ne peuvent pas reproduire pleinement les propriétés structurelles des réseaux dans le cerveau. En outre, l'activité ne peut être enregistrée que pendant moins de 30 minutes à la fois sans un mécanisme fournissant une atmosphère de CO 2 pour que les cellules maintiennent leur équilibre de pH.
Une fois que cette technique est maîtrisée, des manipulations pharmacologiques avec ou sans stimulation électrique peuvent être explorées. De nouveaux protocoles pour sondage de l'apprentissage et la formation de la mémoire dans les réseaux neuronaux peuvent également être conçus et testés, avec pRotocoles pour les réseaux d'halo-ormea ou de la moelle épinière. Des protocoles pour la stimulation et la formation des réseaux ont été précédemment publiés, et certains d'entre eux ont été développés dans des protocoles in vivo , tels que l'adaptation sélective proposée par Eytan et al. 19 . Plusieurs protocoles ont été testés. Cependant, seuls les résultats d'une modification de la procédure du tétanos proposée par Ruaro en 2005 sont présentés ici 14 , 20 .
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par la subvention de la National Science Foundation CMMI-1300007. Nous souhaitons remercier les anciens membres du laboratoire, qui ont contribué à la conception de ces protocoles et au maintien des cultures depuis plus de cinq ans à l'Université George Mason: le Dr Joseph J. Pancrazio, le Dr Hamid Charkhkar, le Dr Gretchen Knaack , Le Dr Franz Hamilton, Michael Maquera et Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |