Этот протокол описывает in vitro сравнение двух ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: связывание с мишенью и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Методы были использованы для сравнения между эталонным ритуксимабом и биоподобным ритуксимабом. Эти анализы можно использовать во время биоподобного развития или в качестве контроля качества в их производстве.
Терапевтические моноклональные антитела (mAbs) имеют отношение к лечению различных патологий, включая раковые образования. Разработка биоподобных mAb фармацевтическими компаниями – это рыночная возможность, но это также стратегия увеличения доступности лекарств и снижения затрат, связанных с терапией. Протоколы, подробно описанные здесь, описывают оценку связывания мишеней и индукцию CDC ритуксимабом в клетках Daudi. Эти две функции требуют различных структурных областей антитела и имеют отношение к клиническому эффекту, индуцированному ритуксимабом. Протоколы позволяют проводить параллельное сравнение эталонного ритуксимаба и биодоступного ритуксимаба. Оцененные продукты демонстрировали различия как в связывании с мишенью, так и в индукции CDC, предполагая, что существуют фундаментальные физико-химические различия и подчеркивается необходимость анализа влияния этих различий в клинических условиях. Описанные здесь методы являются простыми и недорогими in vitro </ Em> для оценки активности биосимиляров ритуксимаба. Таким образом, они могут быть полезны при биоподобном развитии, а также для контроля качества в биоподобном производстве. Кроме того, представленные методы могут быть экстраполированы на другие терапевтические mAb.
Терапевтические антитела представляют собой рекомбинантные моноклональные антитела (mAb), разработанные для лечения различных патологий, включая рак, аутоиммунные и хронические заболевания, неврологические расстройства и другие. 1 . В настоящее время FDA одобрило более 40 терапевтических моноклональных антител, и ожидается, что в последующие годы ожидается их появление на рынке.
Ритуксимаб – это высокоаффинное химерное моноклональное антитело IgG1, одобренное для лечения лимфомы CD20 + В-клеток неходжкинской лимфомы (NHL), CD20 + фолликулярной NHL, хронического лимфолейкоза и ревматоидного артрита 2 , 3 . Признание CD20, который сверхэкспрессируется в В-клетках ритуксимабом, индуцирует апоптоз; Активация комплемента; И антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) 3 . Патенты на этот препарат истекли в Европе и в США в 2013 и 2016 годахСоответственно. Таким образом, фармацевтические компании по всему миру разрабатывают ритуксимаб биоподобий. Как и в любом другом препарате для потребления человека, биоаналоги требуют одобрений регулирующих органов. Международные руководящие принципы показывают , что для МКИ, biosimilarity должна быть продемонстрированы путем сравнения физико – химические характеристики, фармакокинетика, эффективности и безопасности новых и эталонных продуктов 4.
Соответственно, методики, используемые в таких сравнениях должны оценить структурные и функциональные характеристики мАта, особенно с клинической значимостью. С этой целью, анализы в пробирке показывают несколько преимуществ по сравнению с экспериментами в естественных условиях (обзор в Chapman и др.) 5: I) в пробирке исследование более чувствительны к различиям между предлагаемым биоподобием и эталонным продуктом; б) в естественных условиях исследования должны быть выполнен в соответствующих видах, которые в течение многого мАта являютсянечеловеческие приматы; и III) , так как механизм действия, доклинической токсикологии, а также клинических эффектов эталонного продукта, хорошо известны, в естественных условиях исследования с биоподобий не могут обеспечить дополнительную полезную информацию. Соответственно, Руководство Европейского Союза по биоподобиям позволяет кандидатам ввести клинические испытания , основанные на надежном в одних только 6 лабораторных данных.
Здесь мы представляем два быстрых, экономические и простые анализы , которые оценивают биологическую активность ритуксимаба с использованием CD20 + культивируемых клеток. Эти анализы могут быть включены как часть сопоставимости упражнения для ритуксимаба биоподобных кандидатов.
Патентная истечение терапевтического МАБ способствует развитию биоподобий. Таким образом, существует потребность в простых методов, которые могут выявить различия в клинически значимых деятельности этих продуктов. CD20 + культивируемые клетки были использованы для оценки два кл…
The authors have nothing to disclose.
У авторов нет подтверждений.
RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
Fetal bovine serum(FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer. |
Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates |
MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells |
Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |