Dieses Protokoll beschreibt den in vitro – Vergleich von zwei wichtigen funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindungs und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) Induktion. Die Verfahren wurden für eine Seite-an-Seite-Vergleich zwischen Referenz Rituximab und einem Rituximab biosimilar eingesetzt. Diese Assays kann während der Biosimilar Entwicklung oder als Qualitätskontrolle in der Produktion eingesetzt werden.
Therapeutische monoklonale Antikörper (mAbs) sind für die Behandlung von verschiedenen Pathologien, einschließlich Krebs, relevant. Die Entwicklung von biosimilaren mAbs von Pharmaunternehmen ist eine Marktchance, aber es ist auch eine Strategie zur Erhöhung der Arzneimittelzugänglichkeit und zur Verringerung der Therapiekosten. Die hier beschriebenen Protokolle beschreiben die Auswertung der Zielbindung und CDC-Induktion durch Rituximab in Daudi-Zellen. Diese beiden Funktionen erfordern unterschiedliche Strukturregionen des Antikörpers und sind für den durch Rituximab induzierten klinischen Effekt relevant. Die Protokolle erlauben den Seiten-zu-Seite-Vergleich eines Referenz-Rituximab und ein vermarktetes Rituximab-Biosimilar. Die ausgewerteten Produkte zeigten Unterschiede sowohl bei der Zielbindung als auch bei der CDC-Induktion, was darauf hindeutet, dass es physikalisch-chemische Unterschiede gibt und die Notwendigkeit, die Auswirkungen dieser Unterschiede in der klinischen Einstellung zu analysieren, hervorheben. Die hier berichteten Methoden sind in vitro einfach und kostengünstig/ Em> Modelle für die Bewertung der Aktivität von Rituximab Biosimilars. So können sie bei der Biosimilar-Entwicklung sowie bei der Qualitätskontrolle bei der Biosimilar-Produktion nützlich sein. Weiterhin können die vorgestellten Methoden auf andere therapeutische mAbs extrapoliert werden.
Therapeutische Antikörper sind rekombinante monoklonale Antikörper (mAbs) für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten entwickelt, einschließlich Krebs, Autoimmun- und chronischen Krankheiten, neurologische Störungen und andere 1. Derzeit hat die FDA-Zulassung in mehr als 40 therapeutischen mAb gewährt, und mehr wird erwartet, dass der Markt in den kommenden Jahren zu erreichen.
Rituximab ist ein hochaffine chimäre monoklonale IgG1 – Antikörper für die Behandlung von CD20 + B-Zell – Non-Hodgkin-Lymphom zugelassen (NHL), CD20 + follikulärem NHL, chronischer lymphatischer Leukämie und Gelenkrheumatismus 2, 3. Die Erkennung von CD20, die in B-Zellen überexprimiert wird, die von Rituximab Apoptose induziert; Komplementaktivierung; und antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) 3. Die Patente dieser Droge in Europa ausgelaufen und in den USA im Jahr 2013 und 2016, beziehungsweise. So weltweit Pharmaunternehmen Rituximab Biosimilars entwickeln. Wie in jedem anderen Medikament für den menschlichen Verzehr, erfordern Biosimilars Zustimmung von Aufsichtsbehörden. Internationale Richtlinien zeigen , dass für mAbs, biosimilarity sollte durch einen Vergleich der physikalisch – chemischen Eigenschaften, Pharmakokinetik, Wirksamkeit und Sicherheit der neuen und Referenzprodukten 4 gezeigt werden.
Dementsprechend sind die in solchen Vergleichen verwendeten Methoden müssen die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der mAbs, insbesondere solche mit klinischer Relevanz bewerten. Zu diesem Zweck werden in vitro – Tests zeigen mehrere Vorteile gegenüber den in – vivo – Experimenten (rezensiert in Chapman et al.) , 5: i) In – vitro – Studien sind empfindlicher auf Unterschiede zwischen dem vorgeschlagenen biosimilar und das Referenzprodukt; ii) in vivo Studien müssen in entsprechenden Arten durchgeführt werden, die für viele mAbs sindnicht-menschliche Primaten; und iii) Da der Wirkmechanismus, der präklinischen Toxikologie und klinischen Wirkungen des Referenzprodukts , sind gut bekannt, in – vivo – Studien mit biosimilars nicht zusätzliche nützliche Informationen liefern. Dementsprechend ermöglicht die Europäische Union Guidance für Biosimilars Kandidaten klinische Studien in – vitro – Daten allein 6 basierend auf robustes einzugeben.
Hier präsentieren wir zwei schnelle, wirtschaftliche und einfache Tests , die die biologische Aktivität von Rituximab mit CD20 + kultivierten Zellen zu bewerten. Diese Assays können als Teil der Vergleichbarkeit Übung für Rituximab-Biosimilar Kandidaten aufgenommen werden.
Der Patentablauf eines therapeutischen mAb fördert die Entwicklung von Biosimilars. So besteht ein Bedarf an einfachen Methoden, die Unterschiede in den klinisch relevanten Aktivitäten dieser Produkte identifizieren können. CD20 + kultivierte Zellen wurden für die Bewertung von zwei wichtigsten funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindung und CDC-Induktion eingesetzt. Die frühere Aktivität erfordert die Erkennung von CD20 durch die Fab-Region des mAb, während letztere hauptsächlich von der W…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Anerkennung.
RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
Fetal bovine serum(FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer. |
Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates |
MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells |
Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |