Este protocolo descreve a comparação in vitro de duas características funcionais chave de rituximab: ligação ao alvo e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de indução. Os métodos foram utilizados para uma comparação lado-a-lado entre o rituximab referência e um biossimilar rituximab. Estes ensaios podem ser empregues durante o desenvolvimento biológico similar, ou como um controlo de qualidade na sua produção.
Os anticorpos monoclonais (mAbs) terapêuticas são relevantes para o tratamento de diversas patologias, incluindo cancros. O desenvolvimento de mAbs biossimilares pelas empresas farmacêuticas é uma oportunidade de mercado, mas também é uma estratégia para aumentar a acessibilidade de drogas e reduzir os custos associados de terapia. Os protocolos detalhados aqui descrever a avaliação da ligação ao alvo e a indução por CDC rituximab em células Daudi. Estas duas funções requerem diferentes regiões estruturais do anticorpo e são relevantes para o efeito clínico induzido pelo rituximab. Os protocolos permitem a comparação lado-a-lado de uma rituximab referência e um biossimilar rituximab comercializado. Os produtos avaliados apresentaram diferenças tanto na ligação ao alvo e indução CDC, sugerindo que existem diferenças físico-químicas subjacentes e destacando a necessidade de analisar o impacto de tais diferenças no ambiente clínico. Os métodos aqui apresentados constituem simples e barato in vitro </ Em> para a avaliação da atividade dos biossimilares de rituximab. Assim, podem ser úteis durante o desenvolvimento biossimilar, bem como para o controle de qualidade na produção biosimilar. Além disso, os métodos apresentados podem ser extrapolados para outros mAb terapêuticos.
Os anticorpos terapêuticos são anticorpos monoclonais recombinantes (mAbs) desenvolvidos para o tratamento de diferentes patologias, incluindo cancros, doenças autoimunes e crónicas, distúrbios neurológicos e outros 1 . Atualmente, a FDA concedeu a aprovação de mais de 40 mAbs terapêuticos, e mais se espera que cheguem ao mercado nos anos seguintes.
Rituximab é um anticorpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidade aprovado para o tratamento de linfoma não Hodgkin de células B CD20 + (NHL), LNH folicular CD20 + , leucemia linfocítica crónica e artrite reumatóide 2 , 3 . O reconhecimento de CD20, que é sobre-expresso em células B, pelo rituximab induz apoptose; Ativação do complemento; E citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) 3 . As patentes desta droga expiraram na Europa e nos EUA em 2013 e 2016, Respectivamente. Assim, as empresas farmacêuticas em todo o mundo estão desenvolvendo rituximab biosimilares. Como em qualquer outro medicamento para consumo humano, biosimilares requerem aprovação de agências reguladoras. As diretrizes internacionais indicam que, para os mAbs, a biosimilaridade deve ser demonstrada através da comparação das características físico-químicas, farmacocinéticas, eficácia e segurança dos produtos novos e de referência 4 .
Consequentemente, as metodologias utilizadas nestas comparações devem avaliar as características estruturais e funcionais dos mAb, especialmente aqueles com relevância clínica. Para este fim, os ensaios in vitro mostram várias vantagens em relação às experiências in vivo (revisto em Chapman et al. ) 5 : i) os estudos in vitro são mais sensíveis às diferenças entre o biosimilar proposto eo produto de referência; Ii) estudos in vivo devem ser realizados em espécies relevantes, o que para muitos mAbs éprimatas não-humanos; e iii) uma vez que o mecanismo de acção, a toxicologia pré-clínicos, e os efeitos clínicos do produto de referência são bem conhecidas, em estudos in vivo com biosimilars pode não fornecer informação útil adicional. Assim, a orientação da União Europeia para biosimilares permite que os candidatos a entrar ensaios clínicos com base em robusta dados in vitro sozinho 6.
Aqui, apresentamos dois ensaios rápidos, econômicos e simples que avaliam a atividade biológica do rituximab usando células cultivadas CD20 +. Estes ensaios podem ser incluídos como parte do exercício de comparabilidade para os candidatos biossimilares rituximab.
A expiração da patente de um mAb terapêutico está a promover o desenvolvimento de biosimilares. Assim, existe a necessidade de métodos simples que possam identificar diferenças nas actividades clinicamente relevantes destes produtos. Utilizaram-se células cultivadas com CD20 + para a avaliação de duas características funcionais chave do rituximab: ligação ao alvo e indução de CDC. A actividade anterior requer o reconhecimento de CD20 pela região Fab do mAb, enquanto a última depende principalm…
The authors have nothing to disclose.
Os autores não têm agradecimentos.
RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
Fetal bovine serum(FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer. |
Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates |
MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells |
Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |