In Vitro Methoden voor het vergelijken van Target Binding en CDC Inductie Tussen Therapeutische Antilichamen: Toepassingen in Biosimilarity Analysis

Summary

Dit protocol beschrijft de in vitro vergelijking van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en complement-dependent cytotoxicity (CDC) inductie. De methoden werden gebruikt voor een vergelijking tussen referentie rituximab en een rituximab biosimilar. Deze analyses kunnen worden gebruikt bij biosimilar ontwikkeling of als kwaliteitscontrole in hun productie.

Abstract

Therapeutische monoklonale antilichamen (mAbs) zijn op de behandeling van verschillende ziekten, waaronder kanker betrokken. De ontwikkeling van de biosimilar mAbs door farmaceutische bedrijven is een markt kans, maar het is ook een strategie om de drug de toegankelijkheid te verhogen en-therapie bijbehorende kosten te verlagen. De protocollen hier beschreven beschrijven de evaluatie van target binding en CDC inductie door rituximab in Daudi cellen. Deze twee functies vereisen verschillende structurele gebieden van het antilichaam en het klinische effect geïnduceerd door rituximab relevant zijn. De protocollen maken de zij-aan-zij vergelijking van een referentie rituximab en rituximab biosimilair gebracht. De geëvalueerde producten toonden verschillen, zowel in target binden en CDC inductie, wat suggereert dat er onderliggende fysisch-chemische verschillen en het benadrukken van de noodzaak om de gevolgen van die verschillen in de klinische setting te analyseren. De hier beschreven methoden vormen eenvoudig en goedkoop in vitro </ Em> modellen voor de evaluatie van de activiteit van rituximab biosimilars. Zo kunnen ze nuttig zijn bij biosimilar ontwikkeling, evenals voor kwaliteitscontrole bij biosimilar productie. Bovendien kunnen de gepresenteerde methoden worden geëxtrapoleerd aan andere therapeutische mAbs.

Introduction

Therapeutische antilichamen zijn recombinante monoklonale antilichamen (mAbs) ontwikkeld voor de behandeling van verschillende pathologieën, waaronder kanker, auto-immuun en chronische ziekten, neurologische stoornissen en anderen ¹ . Momenteel heeft de FDA goedkeuring verleend aan meer dan 40 therapeutische mAbs, en er wordt verwacht dat de markt de komende jaren zal bereiken.

Rituximab is een chimerisch monoklonaal IgG1-antilichaam met hoge affiniteit, goedgekeurd voor de behandeling van CD20 ⁺ B-cel niet-Hodgkin's lymfoom (NHL), CD20 ⁺ folliculaire NHL, chronische lymfocytische leukemie en reumatoïde artritis ^{2 , 3} . De herkenning van CD20, die overexpressieert in B-cellen, door rituximab induceert apoptose; Complement activatie; En antilichaamafhankelijke cel gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) ³ . De octrooien van dit geneesmiddel verlopen in Europa en in de VS in 2013 en 2016, Respectievelijk. Zo ontwikkelen farmaceutische bedrijven wereldwijd rituximabbiosimilars. Zoals bij een ander geneesmiddel voor menselijke consumptie, biosimilars vereisen goedkeuring van regelgevende agentschappen. Internationale richtlijnen wijzen erop dat biosimilariteit voor mAb's moet worden aangetoond door de fysicochemische eigenschappen, farmacokinetiek, werkzaamheid en veiligheid van de nieuwe en referentieproducten ^{4 te} vergelijken.

Bijgevolg moeten de methoden die in dergelijke vergelijkingen worden gebruikt, de structurele en functionele eigenschappen van de mAb's beoordelen, met name die met klinische relevantie. Daartoe tonen in vitro analyses verschillende voordelen ten opzichte van in vivo experimenten (beoordeeld in Chapman et al. ) ⁵ : i) in vitro studies zijn gevoeliger voor verschillen tussen de voorgestelde biosimilar en het referentieproduct; Ii) in vivo studies moeten worden uitgevoerd in relevante soorten, die voor veel mAbs zijnniet-menselijke primaten; en iii) omdat het werkingsmechanisme, preklinische toxicologie en klinische effecten van het referentieproduct zijn welbekend in vivo studies met biosimilaire kunnen aanvullende nuttige informatie wordt gegeven. Dienovereenkomstig, Begeleiding van de Europese Unie voor biosimilars laat kandidaten om klinische proeven op basis van robuuste in vitro data alleen ⁶ in te voeren.

Hier presenteren we twee snelle, economische en simpele testen die de biologische activiteit van rituximab te evalueren met behulp van CD20 ⁺ gekweekte cellen. Deze tests kunnen worden opgenomen als onderdeel van de vergelijkbaarheid oefening voor rituximab biosimilar kandidaten.

Protocol

1. Evaluatie van Target Binding met flowcytometrie Bereiding van biologische materialen en reagentia Zorg 500 ml RPMI kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (H-IFBS). Lymphoma (Daudi) cellen cultuur Daudi Burkitt's en Daudi GFP + cellen met behulp van RPMI en 75-cm2 kweekflessen. Handhaaf de kweken bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer totdat ze bereiken 6 – 9 x 10 5 cellen / ml. …

Representative Results

Met behulp van de hierboven beschreven protocollen werden de doelbinding en de CDC-inductie van referentie-rituximab in parallel vergeleken met die van een biosimilar rituximab, geproduceerd en in de handel verkrijgbaar in Azië. In Daudi cellen gebonden beide mAbs CD20 op een concentratieafhankelijke wijze ( Figuur 1D ). Niet-lineaire regressies van bindende gegevens vertoonden een r2 van 0.978 en 0.848 voor …

Discussion

Het octrooivertreden van een therapeutisch mAb bevordert de ontwikkeling van biosimilaren. Zo is er behoefte aan eenvoudige methoden die verschillen kunnen identificeren in klinisch relevante activiteiten van deze producten. CD20 ⁺ gekweekte cellen werden gebruikt voor de evaluatie van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en CDC inductie. De vroegere activiteit vereist de herkenning van CD20 door het Fab-gebied van het mAb, terwijl de laatste vooral afhankelijk is van de intera…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.