Seçici etiketli floresan GnRH-I -II ve -III türevleri güvenilir izleme araçları ve bunların hücresel alımı miktarının vardır. Bu yazıda, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli hücre hatlarında Bu GnRH konjugatların alım verimliliğini karşılaştırmak için deneyler getirmektedir.
GnRH analogları etkili hedefleme parçaları ve seçici kötü huylu tümör hücrelerinin hangi yüksek ekspres GnRH reseptörleri içine antikanser ajanları teslim edebiliyoruz. Bununla birlikte, GnRH analogları 'hücre içine kabul edilmesine kantitatif analizi ve GnRH-bazlı ilaç verme sistemlerinde incelenmiştir hücre tipleri şu anda sınırlıdır. Daha önce kişiye, seçici olarak etiketli floresan GnRH I-II ve III türevleri, büyük bir tespit edilebilirliğini sağlar ve tekrarlanabilir ve sağlam deneyler için uygun kimyasal özellikleri vardır. Biz de bu etiketli GnRH analogları uygun up-to-date yöntemleri GnRH-tabanlı ilaç dağıtım sistemleri hakkında yeni bilgiler sunabilir bulundu. GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – – GnRH-II ve [Lys 8 (FITC)] – GnRH Bu yazının [D-Lys 6 (FITC)] hücresel alımında ilgili bazı basit ve hızlı deneyler tanıttı EBC-1 (akciğer) üzerine -III, BxPc-3 (pankreas) ve Detroit-562- (yutak) malign tumor hücreleri. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, GnRH-I reseptörlerinin hücre yüzeyi seviyesi de daha önce ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile GnRH tedaviden sonra, bu hücre hatları üzerinde incelenmiştir. GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama ile nicelendirildi. Bu deneylerde, GnRH analoglarının ve hücre türleri arasında önemli farklılıklar arasında küçük farklılıklar gözlendi. hücre çizgileri arasında önemli farklılıklar, hücre yüzeyi GnRH-I reseptörlerinin onların farklı düzeyde ilişkilidir. kişiye deneyler, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli yapışık hücre kültürleri üzerinde zamana ve konsantrasyona bağlı bir şekilde GnRH FITC konjugat alımı verimi karşılaştırma pratik yöntemler içerir. Bu sonuçlar verilen hücre kültürü üzerinde GnRH konjugatları ilaç hedefleme verimini tahmin ve GnRH-tabanlı ilaç taşıyıcı sistemlerin incelenmesi daha fazla deneyler için iyi bir temel sunabilir.
Peptid bazlı hedeflenmiş ilaç taşıyıcı sistemler son birkaç yıldır 1, 2 üzerinde kanser tedavisinde hızlı bir gelişen ve gelecek vaat eden bölgeyi haline gelmiştir. İnsan Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptör tip I (GnRH-IR) öncelikle hipofiz bezi bulunur ama aynı zamanda kendini üreme 3 sorumlu diğer bazı dokularda mevcut mesafesindedir. GnRH-IR üreme sistemi 4, 5 ile ilgili ya da ilgisiz, kanserli dokuların bir dizi olarak ifade edilmektedir. Sağlıklı dokular ile karşılaştırıldığında birçok habis tümör hücreleri üzerindeki GnRH-IR yüksek ifadesi hedeflenmiş tedavinin 5, 6 için bir fırsat sağlar.
Birçok gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) analogları hedefleme parçaları olarak kullanılabilir, son birkaç on yıl içinde geliştirilmiştirf "> 7, 8, 9. Bu peptidler habis tümör hücrelerine yüksek seçicilikle antikanser ajanları vermek için mümkün olan aşırı ifade GnRH-IR 6. tekabül eden konjuge olmayan daha yüksek seçicilik ve daha iyi bir verim ile birkaç GnRH bağlı anti-tümör ilaç serbest ilaç, 8, 9 7 bildirilmiştir.
GnRH peptidlerinin ve bunların reseptörleri ile ilgili önceki yayınların GnRH İR GnRH 10 analogları için farklı seçiciliğe sahip çeşitli konfigürasyonlar varsayabiliriz bildirmiştir. Son derece değişken GnRH İR karmaşık ve çeşitli sinyal yolları doğal ve yapay ligandlar 11 karşı farklı bir aktivite ile donatıldığı şaşırtıcı şekilde bulunmuştur sahiptir. Bu gerçekler GnRH-tabanlı sistemlerin incelenmesi zorlu olun. Öte yandan, y umut verici terapötik potansiyele sahiptir. Radyo işaretli GnRH peptit ile yaptığı deneyler, daha önce burada floresan etiketli GnRH analogları kullanıldı, 12, 13, 14, 15, fakat deneyler rapor edilmiştir de sınırlıdır. Radyoaktif etiket yüksek hassasiyet sağlarken, floresan etiketleme birçok avantaj, örneğin, daha kolay kullanım ve farklı fluorophores counterstain yeteneğine sahiptir. Başarılı bir şekilde ilaç iletimi için kullanılmıştır Üç yaygın GnRH analogları -GnRH-l, [D-Lys 6] -GnRH II ve GnRH-III fakat hedefleme parçaları olarak bu peptidlerin etkinliği [6, D-Lys] olan nadiren, 17 16 karşılaştırdık. Diğer taraftan, farklı kanser hücreleri ve GnRH analogları kullanılmış olan ayrı deneylerden elde edilen sonuçlar farklı.
Bu düşünceler dayanarak ntent ">, bu GnRH peptidler hedef tümör ve ilaç dağıtım potansiyeli üzerinde duruldu ve bu suretle de sentezlenen ve [D-Lys 6 (FITC)] karakterize – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH II ve [Lys 8 (FITC)] – GnRH III peptid birleşikleri 18 Bu analoglar seçmeli olarak Lys ya da D-Lys (peptid-FITC oranı yan zinciri 1 FITC ile etiketlenmiştir: her biri 1. konjuge). Fikir seçici floresan etiketleme bu peptitler hakkında yeni bilgiler sunmak ve onların iyi izleme ve güvenilir ölçümü sağlar ki oldu. bu konjügatlar daha kolay onların tümör hedefleme verimini karşılaştırmak yapmak güvenli kullanım ve güvenilir tespit edilebilirliğini var, ve malign tümör hücrelerinin çok sayıda türde tarama. Biz up-to bu peptid konjugatları ile tarih deneyleri GnRH-ilaç konjugatları hedefleyen yeni kanser gelişimine katkıda ve yeni tedavi tar tanımlamak için yardımcı olabilir umuyoruzde alır.Mevcut el yazması GnRH-FITC konjugatları ile bazı iyi tekrarlanabilir ve hızlı deneyler gösteriyor. GnRH-R'nin hücre yüzey ifadesi bu nedenle eş zamanlı olarak test edilen hücre hatları üzerinde GnRH-IR, hücre yüzeyi seviyesine araştırıldı GnRH alımı ile ilgili belirleyici bir durumdur. Bu konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile GnRH IR ve GnRH-FITC birleşikleri görsel ve floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul ölçülmüştür.
Deneyler eleme yapışık seçici olarak etiketlenmiş GnRH analoglarını kullanım tarif in vitro hücre kültürleri. Konfokal mikroskopi ve sitometrisi yöntemleri takip için uygun bir süre ve konsantrasyon bağımlı bir tarzda, bu GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul miktarının olan akar. Bu deneyler aşağıdaki kritik adımlar vardır: 1) steril, sağlıklı hücre kültürü korumak; 2) GnRH peptidler yüksek kalitede olmalıdır; 3) makul konsantrasyonları ve inkübasyon sü…
The authors have nothing to disclose.
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |