Selettivamente l'etichetta fluorescente GnRH-I, -II e -III derivati sono strumenti affidabili per il monitoraggio e la quantificazione loro assorbimento cellulare. Questo manoscritto introduce esperimenti di visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di questi coniugati GnRH in diverse linee cellulari.
analoghi del GnRH sono efficaci frazioni di targeting e in grado di fornire agenti antitumorali selettivamente nelle cellule tumorali maligne che i recettori del GnRH altamente espresso. Tuttavia, l'analisi quantitativa di assorbimento cellulare GnRH analoghi 'ei tipi di cellule indagati in sistemi di drug delivery GnRH-based sono attualmente limitati. In precedenza introdotto, fluorescente selettivamente etichettato GnRH I, -II e -III derivati fornire grande rilevabilità, e hanno gli immobili chimici per esperimenti riproducibili e robusti. Abbiamo anche trovato che i metodi appropriati up-to-date con questi analoghi del GnRH etichettati potrebbero offrire nuove informazioni sui sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH. Questo manoscritto introduce alcuni esperimenti semplici e veloci per quanto riguarda l'assorbimento cellulare di [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II e [Lys 8 (CIC)] – GnRH -III sulla EBC-1 (polmone), la BxPC-3 (pancreas) e sul Detroit-562- (faringe) maligno tumor cellule. Parallelamente a queste coniugati GnRH-FITC, il livello della superficie cellulare dei recettori GnRH-I è stato esaminato anche su queste linee cellulari, prima e dopo il trattamento GnRH dal microscopio confocale a scansione laser. L'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC è stato quantificato con la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule. In questi esperimenti è stata osservata piccole differenze tra analoghi del GnRH e le principali differenze tra i tipi di cellule. Le differenze significative tra le linee cellulari sono correlati con il loro livello distinto di recettori di superficie delle cellule GnRH-I. Gli esperimenti introdotti contengono metodi pratici per visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di coniugati GnRH-FITC in un tempo e modo dipendente dalla concentrazione su varie colture cellulari aderenti. Questi risultati potrebbero prevedere il drug targeting efficienza dei coniugati GnRH sulla data coltura cellulare, e di offrire una buona base per ulteriori esperimenti in esame dei sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH.
Sistemi di drug delivery mirati a base di peptidi sono diventati un rapido sviluppo e la zona promettente nella terapia del cancro negli ultimi anni 1, 2. Gonadotropina umana di tipo rilasciando recettore dell'ormone I (GnRH-IR) si trova principalmente nella ghiandola pituitaria, ma è presente anche in molti altri tessuti che sono responsabili per l'auto-riproduzione 3. GnRH-IR si esprime anche in un certo numero di tessuti tumorali, collegate o indipendenti per il sistema riproduttivo 4, 5. L'elevata espressione di GnRH-IR in diverse cellule tumorali maligne rispetto ai tessuti sani prevede la possibilità per la terapia mirata 5, 6.
Molti dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) analoghi sono stati sviluppati negli ultimi decenni, che potrebbero essere utilizzati come target porzionif "> 7, 8, 9. Questi peptidi sono in grado di rilasciare agenti antitumorali con elevata selettività in cellule tumorali maligne che over-esprimono GnRH-IR 6. Diversi GnRH farmaci anti-tumorali coniugati con elevata selettività e migliore efficienza rispetto al corrispondente coniugato droga libera sono stati segnalati 7, 8, 9.
Precedenti pubblicazioni su peptidi GnRH e dei loro recettori hanno riferito che il GnRH-IR può assumere diverse conformazioni che hanno selettività diverso per GnRH analoghi della 10. Il GnRH-IR altamente variabile ha vie di segnalazione complesse e varie sono dotati di diversa attività contro i loro ligandi naturali e artificiali 11. Questi fatti fanno indagini di sistemi basati su GnRH impegnativo. D'altra parte, la y possiedono potenziale terapeutico promettente. Diversi esperimenti con peptidi radiomarcati GnRH sono stati precedentemente riportati 12, 13, 14, 15, ma esperimenti in cui sono stati usati gli analoghi del GnRH fluorescente sono ancora limitate. Mentre marcatura radioattiva offre alta sensibilità, marcatura fluorescente ha diversi altri vantaggi, ad esempio la maneggevolezza e la capacità di colorazione di contrasto con differenti fluorofori. Tre analoghi del GnRH comuni che sono stati usati con successo per somministrazione di farmaci sono i [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II e III-GnRH, ma l'efficacia di questi peptidi come porzioni di targeting è raramente rispetto 16, 17. D'altro canto, i risultati di esperimenti separati in cui sono stati utilizzati differenti cellule tumorali e analoghi GnRH è varia.
S copi "> Sulla base di queste considerazioni, si concentra sul tumore targeting e potenziale drug delivery di questi peptidi GnRH, e così sintetizzato e caratterizzato [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] – GnRH-III coniugati peptide 18 Questi analoghi sono selettivamente etichettati con FITC sulla catena laterale di loro (rapporto peptide-FITC Lys o D-Lys 1: 1 in ogni. coniugato). l'idea era che l'etichettatura fluorescente selettivo in grado di offrire nuove informazioni su questi peptidi, e permette loro buon monitoraggio e la quantificazione affidabile. questi coniugati hanno una manipolazione sicura e rilevabilità affidabile, che rendono più facile per confrontare il loro tumore efficienza targeting e la proiezione di numerosi tipi di cellule tumorali maligne. speriamo che fino a esperimenti data con questi coniugati peptide potrebbe contribuire allo sviluppo del cancro romanzo mira coniugati GnRH-droga, e contribuire ad individuare nuove tar terapeuticoottiene pure.Il presente manoscritto dimostra alcuni esperimenti ben riproducibili e veloci con coniugati GnRH-FITC. L'espressione superficie cellulare di GnRH-R è una condizione determinante per quanto riguarda l'assorbimento del GnRH, quindi abbiamo studiato contemporaneamente il livello della superficie cellulare di GnRH-IR sulle linee cellulari testate. Abbiamo visualizzato il coniugati GnRH-IR e GnRH-FITC da confocale a scansione laser microscopia (CLSM) e quantificato l'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC utilizzando celle a fluorescenza-attivato (FACS).
Gli esperimenti descritti nel presente documento utilizzare analoghi del GnRH selettivamente etichettati per lo screening aderenti colture cellulari in vitro. La microscopia confocale e citometria a flusso metodi sono adatti per il monitoraggio e la quantificazione l'assorbimento cellulare di questi coniugati GnRH-FITC in un tempo e concentrazione modo dipendente. Questi esperimenti hanno i seguenti passaggi critici: 1) mantenere una cultura di cellule sane sterili; 2) peptidi GnRH devono essere …
The authors have nothing to disclose.
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |