في المختبر التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر
Summary
وصفت بشكل انتقائي نيون نره-I،-II و-III المشتقات هي أدوات موثوقة لتتبع وقياس امتصاص الخلوية الخاصة بهم. هذه المخطوطة يقدم تجارب لتصور وقياس ومقارنة كفاءة امتصاص هذه تقارن نره في خطوط الخلايا المختلفة.
Abstract
نظائرها نره هي الأنصاف تستهدف فعالة وقادرة على تقديم وكلاء المضادة للسرطان بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية الخبيثة التي مستقبلات نره صريحة للغاية. ومع ذلك، فإن التحليل الكمي للامتصاص الخلوية نظائرها نره "وأنواع الخلايا التحقيق في أنظمة توصيل الدواء على أساس نره تقتصر حاليا. سبق عرضه، فلوري المسمى انتقائي نره الأول،-II و-III المشتقات نقدم الكشف العظيم، ولهم خصائص كيميائية مناسبة للتجارب متكررة وقوية. لقد وجدنا أيضا أن أساليب يصل إلى تاريخ المناسبة مع هذه نظائرها نره المسمى يمكن أن توفر معلومات جديدة حول أنظمة توصيل الدواء على أساس نره. هذه المخطوطة يقدم بعض التجارب بسيطة وسريعة فيما يتعلق امتصاص الخلوية من [D-ليز 6 (FITC)] – نره-I، [D-ليز 6 (FITC)] – نره-II و [ليز 8 (FITC)] – [نره] -III على EBC-1 (الرئة)، وBxPC-3 (البنكرياس) وعلى ديترويت-562- (البلعوم) ر الخبيثخلايا umor. بالتوازي مع هذه تقارن نره-FITC، تم فحص مستوى سطح الخلية من المستقبلات نره-I أيضا على هذه الخطوط الخلية قبل وبعد العلاج نره من قبل متحد البؤر المجهر الليزر. وكميا امتصاص الخلوي للتقارن نره-FITC بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز. في هذه التجارب لوحظ اختلافات بسيطة بين نظائرها نره واختلافات كبيرة بين أنواع الخلايا. وترتبط الفوارق الكبيرة بين خطوط الخلايا مع مستوى متميز على سطح الخلايا مستقبلات نره-I. تحتوي على تجارب أدخلت أساليب عملية لتصور وقياس ومقارنة كفاءة امتصاص تقارن نره-FITC في وقت واحد، وبطريقة تعتمد على التركيز على مختلف الثقافات الخلايا الملتصقة. هذه النتائج يمكن التنبؤ تستهدف المخدرات كفاءة تقارن نره على ثقافة خلية معينة، وتوفر أساسا جيدا لمزيد من التجارب في فحص أنظمة توصيل الدواء على أساس نره.
Introduction
أصبحت تستند نظم تسليم المخدرات المستهدفة الببتيد ويتطور بسرعة ومنطقة واعدة في علاج السرطان خلال السنوات القليلة الماضية 1 و 2. موجهة الغدد التناسلية البشرية نوع الإفراج عن مستقبلات هرمون الأول (نره-IR) يقع في المقام الأول في الغدة النخامية ولكن موجود أيضا في العديد من الأنسجة الأخرى التي هي المسؤولة عن الاستنساخ الذاتي 3. وأعرب عن نره الأشعة تحت الحمراء أيضا في عدد من الأنسجة السرطانية، ذات الصلة، أو لا علاقة لها الجهاز التناسلي 4، 5. التعبير عال من نره الأشعة تحت الحمراء في العديد من الخلايا السرطانية الخبيثة مقارنة مع الأنسجة السليمة يوفر فرصة للعلاج المستهدفة 5، 6.
العديد من الهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية وقد تم تطوير (نره]) نظائرها في العقود القليلة الماضية، والتي يمكن أن تستخدم استهداف الأنصافو "> 7، 8، 9، وهذه الببتيدات هي قادرة على تقديم وكلاء المضادة للسرطان مع الانتقائية العالية في الخلايا السرطانية الخبيثة التي الإفراط في التعبير عن نره الأشعة تحت الحمراء 6. عدة نره مترافق الأدوية المضادة للورم مع ارتفاع الانتقائية وأفضل كفاءة من اللامقترن المقابلة وقد تم الإبلاغ عن خال من المخدرات 7، 8، 9.
وذكرت المنشورات السابقة عن الببتيدات نره ومستقبلاتها أن نره الأشعة تحت الحمراء يمكن أن تتحمل مختلف التشكلات التي لها الانتقائية مختلفة لنظائرها نره 10. وقد وهبت لاختلافا كبيرا نره-IR مسارات الإشارات المعقدة والمختلفة مع نشاط مختلف ضد بروابط الطبيعية والاصطناعية من 11. هذه الحقائق تجعل التحقيق في النظم القائمة نره-تحديا. من ناحية أخرى، ذ تمتلك إمكانات علاجية واعدة. العديد من التجارب مع الببتيدات نره رديولبلد كانت أعلنت في وقت سابق 12، 13، 14، 15، ولكن التجارب التي استخدمت fluorescently المسمى نظائرها نره لا تزال محدودة. في حين يقدم وسم المشعة حساسية عالية، ووضع العلامات الفلورية ديها العديد من المزايا الأخرى، على سبيل المثال تسهيل التعامل، والقدرة على مباين مع fluorophores مختلفة. ثلاثة نظائر نره المشتركة التي استخدمت بنجاح لتسليم المخدرات هي [D-ليز 6] -GnRH-I، [D-ليز 6] -GnRH-II ونره الثاني والثالث، ولكن فعالية هذه الببتيدات كما الأنصاف الاستهداف نادرا مقارنة 16، 17. من ناحية أخرى، والنتائج من تجارب منفصلة استخدمت فيها الخلايا السرطانية المختلفة ونظائرها نره متنوعة.
ntent "> وبناء على هذه الاعتبارات، ركزنا على الورم الاستهداف وإمكانية تسليم المخدرات من هذه الببتيدات نره، وبالتالي توليفها وتميزت [D-ليز 6 (FITC)] – نره-I، [D-ليز 6 (FITC )] – تقارن الببتيد نره الثالث 18 وصفت هذه نظائرها بشكل انتقائي مع FITC على سلسلة من الجانب اليس أو D-ليز (نسبة الببتيد FITC من 1 – [ليز 8 (FITC)] نره-II و: 1 في كل. وكانت فكرة المترافقة) أن وضع العلامات الفلورية انتقائية يمكن أن تقدم معلومات جديدة حول هذه الببتيدات، ويسمح لهم تتبع جيد وتقدير موثوق بها. هذه تقارن لها التعامل الآمن وكشف موثوق بها، مما يجعل من الاسهل لمقارنة الورم تستهدف كفاءتها، و فحص أنواع عديدة من الخلايا السرطانية الخبيثة، ونحن نأمل أن ما يصل إلى التجارب موعد مع هذه تقارن الببتيد يمكن أن تسهم في تطور سرطان رواية تستهدف تقارن نره من المخدرات، وتساعد على تحديد القطران العلاجي الجديديحصل أيضا.يوضح هذا المخطوط بعض التجارب استنساخه بشكل جيد وسريع مع تقارن نره-FITC. التعبير سطح الخلية من نره-R هو شرط حاسمة من حول امتصاص نره، وبالتالي فإننا التحقيق في وقت واحد على مستوى سطح الخلية من نره الأشعة تحت الحمراء على خطوط الخلايا التي تم اختبارها. نحن تصور تقارن نره الأشعة تحت الحمراء ونره-FITC التي كتبها متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) وكمية امتصاص الخلوي للتقارن نره-FITC باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
التجارب وصفت هنا استخدام المسمى انتقائي نظائرها نره لتمسكا فحص مزارع الخلايا في المختبر. المجهر متحد البؤر والتدفق الخلوي طرق مناسبة لتتبع وقياس امتصاص الخلوية من هذه تقارن-نره FITC في وقت وتركيز بطريقة تعتمد. هذه التجارب لها الخطوات الهامة التالية: 1) الحفا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
- Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists – A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
