Sélectivement marqué fluorescent GnRH-I, -II et -III dérivés sont des outils fiables pour le suivi et la quantification de leur absorption cellulaire. Ce manuscrit présente des expériences pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité d'absorption de ces conjugués de GnRH dans diverses lignées cellulaires.
analogues de la GnRH sont des fragments de ciblage efficaces et capables de délivrer des agents anti-cancéreux de manière sélective dans des cellules tumorales malignes qui expriment fortement les récepteurs de la GnRH. Cependant, l'analyse quantitative de l'absorption cellulaire des analogues de la GnRH et les types cellulaires étudiés dans les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH sont actuellement limitées. Auparavant introduit, marqué par fluorescence sélective GnRH I, -II et -III dérivés fournir une grande détectabilité, et ils ont des propriétés chimiques appropriés pour des expériences reproductibles et robustes. Nous avons également constaté que les méthodes mises à jour appropriées avec ces analogues de la GnRH marqués pourraient offrir des informations inédites sur les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH. Ce manuscrit présente quelques expériences simples et rapides en ce qui concerne l'absorption cellulaire de [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II et [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III sur l'EBC-1 (poumon), le BxPC-3 (pancréas) et sur le Detroit 562- (pharynx) t malignesumor cellules. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, le niveau des récepteurs de la GnRH-I de surface cellulaire a également été examinée sur ces lignées cellulaires avant et après le traitement à la GnRH par microscopie confocale à balayage laser. L'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC a été quantifié par tri cellulaire activé par fluorescence. Dans ces expériences, des différences mineures entre les analogues de la GnRH et de grandes différences entre les types de cellules a été observée. Les différences significatives entre les lignées cellulaires sont mises en corrélation avec leur niveau distinct de récepteurs de surface cellulaire GnRH-I. Les expériences présentées contiennent des méthodes pratiques pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité de l'absorption de conjugués GnRH-FITC dans un temps et de manière dépendante de la concentration sur les différentes cultures de cellules adhérentes. Ces résultats pourraient prédire l'efficacité des médicaments ciblant des conjugués GnRH sur la culture cellulaire donné, et d'offrir une bonne base pour d'autres expériences dans l'examen des systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH.
Systèmes de délivrance de médicaments peptidiques à base ciblées sont devenues un développement rapide et domaine prometteur dans le traitement du cancer au cours des dernières années 1, 2. La gonadotrophine humaine de type récepteur d'hormone de libération de I (GnRH-IR) est principalement situé dans la glande pituitaire , mais est aussi présent dans plusieurs autres tissus qui sont responsables de l' autoreproduction 3. GnRH-IR est également exprimée dans de nombreux tissus cancéreux, liés ou non au système reproducteur 4, 5. L'expression élevée de GnRH-IR sur plusieurs cellules tumorales malignes par rapport aux tissus sains est l'occasion pour la thérapie ciblée 5, 6.
Beaucoup gonadolibérine (GnRH) analogues ont été développés au cours des dernières décennies, qui pourraient être utilisés comme groupements de ciblagef "> 7, 8, 9. Ces peptides sont capables de délivrer des agents anticancéreux avec une sélectivité élevée dans les cellules tumorales malignes qui surexpriment GnRH-IR 6. Plusieurs médicaments anti-tumoraux conjugués GnRH avec une sélectivité plus élevée et une meilleure efficacité que le non conjugué correspondant sans drogue ont été signalés 7, 8, 9.
Les publications précédentes au sujet de peptides GnRH et leurs récepteurs ont indiqué que le GnRH-IR peut prendre différentes conformations qui ont sélectivité différente pour GnRH analogues de 10. La GnRH-IR très variable a des voies de signalisation complexes et diverses sont dotés d' une activité différente contre leurs ligands naturels et artificiels 11. Ces faits font enquête sur les systèmes basés sur la GnRH difficile. D'autre part, la y possèdent un potentiel thérapeutique prometteur. Plusieurs expériences avec des peptides GnRH radiomarqués ont été signalés précédemment 12, 13, 14, 15, mais des expériences dans lesquelles analogues de la GnRH marqués par fluorescence ont été utilisés sont encore limitées. Bien que le marquage radioactif offre une sensibilité élevée, un marquage fluorescent a plusieurs autres avantages, par exemple la manipulation plus facile, et la capacité de contre-colorer avec des fluorophores différents. Trois analogues de la GnRH communes qui ont été utilisées avec succès pour la délivrance de médicaments sont le [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II et GnRH-III, mais l'efficacité de ces peptides comme fragments de ciblage est rarement contre 16, 17. D'autre part, les résultats d'expériences distinctes dans lesquelles des cellules cancéreuses différentes et des analogues de la GnRH ont été utilisés sont divers.
MÉNAGEMENT "> Sur la base de ces considérations, nous nous sommes concentrés sur le ciblage de la tumeur et le potentiel de distribution de médicaments de ces peptides de la GnRH et, par conséquent synthétisé et caractérisé par la [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II et [Lys 8 (FITC)] – peptides conjugués GnRH-III 18 Ces analogues sont sélectivement marqués par la FITC sur la chaîne latérale de la Lys ou D-Lys (rapport peptide-FITC 1: 1 à chacun. conjugué). l'idée était que le marquage fluorescent sélectif peut offrir des informations inédites sur ces peptides, et permet leur bonne suivi et une quantification fiable. ces conjugués ont une manipulation sûre et détectabilité fiable, ce qui rend plus facile de comparer leur tumeur efficacité du ciblage, et projection de nombreux types de cellules tumorales malignes. Nous espérons que la mise à jour des expériences avec ces conjugués peptidiques pourrait contribuer au développement de nouveaux cancer ciblant conjugués GnRH-médicaments, et d'aider à identifier de nouvelles tar thérapeutiqueobtient ainsi.Le présent manuscrit démontre quelques expériences bien reproductibles et rapides avec des conjugués GnRH-FITC. L'expression de surface cellulaire de la GnRH-R est une condition déterminante en ce qui concerne l'absorption de la GnRH, par conséquent, nous avons étudié simultanément le niveau de la GnRH-IR à la surface cellulaire sur les lignées cellulaires testées. Nous avons visualisé les conjugués GnRH-IR et GnRH-FITC par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et quantifié l'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC en utilisant les cellules activées par fluorescence (FACS).
Les expériences décrites ici utiliser analogues de la GnRH marqués sélectivement pour le dépistage adhérent des cultures de cellules in vitro. La microscopie confocale et cytométrie de flux méthodes sont appropriées pour le suivi et la quantification de l'absorption cellulaire de ces conjugués de GnRH-FITC en un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Ces expériences ont les étapes essentielles suivantes: 1) maintenir une culture cellulaire stérile, en bonne sant…
The authors have nothing to disclose.
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |