Selectief gemerkte fluorescerende GnRH-I, -II en -III derivaten betrouwbare middelen voor het opsporen en kwantificeren van de cellulaire opname. Dit manuscript introduceert experimenten te visualiseren, kwantificeren en te vergelijken de opname efficiëntie van deze GnRH conjugaten in diverse cellijnen.
GnRH-analogen zijn effectief doelgerichte eenheden en in staat om antikanker middelen te leveren selectief in kwaadaardige tumorcellen die zeer uitdrukkelijke GnRH-receptoren. Echter, de kwantitatieve analyse van cellulaire opname GnRH analogen en de onderzochte celtypen in-GnRH gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen momenteel beperkt. Eerder introduceerde, selectief gelabeld fluorescerende GnRH I, -II en -III derivaten zorgen voor een grote detecteerbaarheid, en ze hebben voldoende chemische eigenschappen voor reproduceerbare en robuuste experimenten. We vonden ook dat de nodige up-to-date methoden met deze gelabeld GnRH-analogen roman informatie over de GnRH-based drug delivery systemen kon bieden. Dit manuscript introduceert een aantal eenvoudige en snelle experimenten met betrekking tot de cellulaire opname van [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III op de EBC-1 (long), de BxPC-3 (alvleesklier) en de Detroit-562- (farynx) maligne tumor cellen. Parallel aan deze GnRH-FITC-conjugaten werd het celoppervlak niveau van GnRH-I receptoren onderzocht in de volgende cellijnen voor en na de behandeling met GnRH confocale laser scanning microscopie. De cellulaire opname van GnRH-FITC-conjugaten werd gekwantificeerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering. In deze experimenten kleine verschillen tussen GnRH analogen en grote verschillen tussen celtypes waargenomen. De significante verschillen tussen cellijnen worden gecorreleerd met hun verschillende niveau van celoppervlakte GnRH-I receptoren. De geïntroduceerde experimenten bevatten praktische methoden te visualiseren, kwantificeren en vergelijk de opname-efficiëntie van GnRH-FITC-conjugaten in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze op verschillende hechtende celculturen. Deze resultaten kunnen de drug targeting efficiëntie van GnRH conjugaten op de gegeven celkweek te voorspellen, en bieden een goede basis voor verdere experimenten in het onderzoek van GnRH-gebaseerde drug delivery systemen.
Peptide-gebaseerde gerichte toediening van medicijnen systemen zijn uitgegroeid tot een snelle ontwikkeling en veelbelovend gebied in de behandeling van kanker in de afgelopen jaren 1, 2. Menselijke gonadotropin-releasing hormone receptor type I (GnRH-IR) is voornamelijk in de hypofyse, maar is ook aanwezig in verschillende andere weefsels die verantwoordelijk zijn voor zelfreproductie 3 zijn. GnRH-IR zich ook in een aantal kankerweefsels, al dan niet verbonden met het voortplantingssysteem 4, 5. De hoge expressie van GnRH-IR verschillende kwaadaardige tumorcellen in vergelijking met gezonde weefsels biedt een gelegenheid voor gerichte therapie 5, 6.
Veel gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogen ontwikkeld in de afgelopen decennia, die kunnen worden gebruikt als richtende delenf "> 7, 8, 9. Deze peptiden kunnen antikankermiddelen met hoge selectiviteit geven in kwaadaardige tumorcellen die overexpressie GnRH-IR 6. Verscheidene GnRH geconjugeerd anti-tumor geneesmiddelen met hogere selectiviteit en hoger rendement dan de corresponderende niet-geconjugeerde vrije geneesmiddel gerapporteerd 7, 8, 9.
Vorige publicaties over GnRH-peptiden en hun receptoren gemeld dat de GnRH-IR verschillende conformaties die verschillende selectiviteit hebben voor GnRH analogen 10 kan aannemen. De sterk wisselende GnRH-IR is complex en diverse signaalwegen zijn begiftigd met verschillende activiteiten tegen hun natuurlijke en kunstmatige liganden 11. Deze feiten maken onderzoek naar GnRH-gebaseerde systemen uitdagend. Anderzijds, de y bezitten veelbelovende therapeutisch potentieel. Verschillende experimenten met gelabeld GnRH peptiden werden eerder gemeld 12, 13, 14, 15, maar experimenten waarbij fluorescent gelabelde GnRH analogen werden nog beperkt. Terwijl radioactief merken biedt een hoge gevoeligheid, fluorescente labeling heeft een aantal andere voordelen, zoals de eenvoudige bediening en de mogelijkheid om tegenkleuring met verschillende fluoroforen. Drie gemeenschappelijke GnRH-analogen die met succes zijn gebruikt voor geneesmiddelafgifte zijn [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II en GnRH-III, maar de doeltreffendheid van deze peptiden als doelgerichte eenheden is zelden vergeleken 16, 17. Aan de andere kant, resultaten van afzonderlijke experimenten waarin verschillende kankercellen en GnRH analogen werden gebruikt divers.
ntent "> Op basis van deze overwegingen hebben we ons gericht op de tumor targeting en geneesmiddelafgifte potentieel van deze GnRH peptiden en daardoor gesynthetiseerd en gekarakteriseerd het [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] – GnRH-III peptideconjugaten 18 Deze analogen worden selectief gelabeld met FITC aan de zijketen van hun Lys of D-Lys (peptide-FITC verhouding 1: 1 naar elkaar. conjugaat). het idee was dat de selectieve fluorescentielabelling nieuwe informatie over deze peptiden kunnen bieden, en maakt hun goede tracking en betrouwbare kwantificatie. deze conjugaten veilig hanteren en betrouwbaar detecteerbaarheid, die het gemakkelijker om hun tumor targeting efficiëntie te vergelijken, en de screening van verschillende typen kwaadaardige tumorcellen. We hopen dat up-to-date experimenten met deze peptide-conjugaten kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe kanker gericht GnRH-geneesmiddel conjugaten en helpen nieuwe therapeutische tar identificerenkrijgt ook.De huidige manuscript toont een aantal goed reproduceerbare en snelle experimenten met GnRH-FITC conjugaten. Het celoppervlak expressie van GnRH-R bepalende voorwaarde van GnRH opname dus we gelijktijdig onderzocht het celoppervlak niveau van GnRH-IR van de geteste cellijnen. We gevisualiseerd de GnRH-IR en GnRH-FITC conjugaten van confocale laser scanning microscopie (CLSM) en gekwantificeerd de cellulaire opname van GnRH-FITC conjugaten middels fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
Experimenten hierin beschreven gebruiken selectief gelabeld GnRH analogen voor screening hechtende celculturen in vitro. Confocale microscopie en flowcytometrie werkwijzen zijn geschikt voor het volgen en kwantificeren van de cellulaire opname van deze GnRH-FITC-conjugaten in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Deze experimenten hebben de volgende belangrijke stappen: 1) handhaven van een steriele, gezonde celkweek; 2) GnRH-peptiden moet van hoge kwaliteit zijn; 3) redelijke concentraties en…
The authors have nothing to disclose.
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |