Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Перепрограммировать клетки условно (ЗПК) обеспечивают устойчивый метод для первичной культуры клеток и способности развивать обширные «живой» биобанках пациента клеточных линиях. Для многих типов эпителиальных клеток, различные трехмерные подходы (3D) культуры было описано, что поддерживают улучшенное дифференцированное состояние. В то время как вычисление контрольной суммы сохраняют свою коммитирование к ткани, из которой они изолированы, они не выражают многие из маркеров дифференцировки, ассоциированных с тканью происхождения при выращивании в нормальных условиях двух двухмерных (2D) культуры. Для повышения применение ОЦР пациента, полученных для исследования рака простаты, 3D-формат культура была определена, что позволяет быстро (за 2 недели всего) люминальную дифференцировки клеток в нормальных и опухолевых полученных эпителиальных клеток простаты. При этом фильтрующий элемент на основе формата описан для культивирования и дифференцировки нормальных и злокачественных ОЦР простаты. дехвостатые описание процедур, необходимых для сбора клеток и обработки для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания предоставляются. Коллективно формат культура 3D описано в сочетании с первичными линиями CRC, обеспечивает важные средне- и высоко- пропускную способность системы для модели biospecimen на основе исследования простаты.
Идентификация и использование методов лечения рака, которые являются персонифицированными для отдельных лиц являются основной целью в исследовании рака. В последнее время новые подходы были разработаны, которые позволяют большей легкостью в создании первичных клеточных культур, потенциально обеспечивая способы и определения и тестирования персонализированных терапии. Например, R-spondin основе простаты Органоид подход 1 позволяет для трехмерных (3D) культивирование нормальных и метастатических клеток рака простаты в коммерческом внеклеточного матрикса (например, Матригель), в то время как метод Кондиционно Перепрограммирование клеток (CRC) разработанный в Джорджтауне 2, 3 использует более стандартных условий 2D культуры. В частности, сочетание ингибитора киназы Rho (Y-27632) и облучают J2 мышиных фидерных клеток фибробластов приводит к неопределенному культивировании кератиноцитов контрольных сумм 2. Методология CRC являетсячрезвычайно прочный, с основными клеточные линии успешно установлены и сохраняться неопределенно долго от простаты и многих других нормальных и злокачественных эпителиальных тканей 3. Важно отметить, что наша CRC технология позволила для быстрой идентификации этиологической основы для рецидивирующего респираторного папилломатоза у пациента, который потерпел неудачу ряд предыдущих лекарственной терапии. Кроме того, с использованием нормальных и опухолевых полученных ЗПК, успешная идентификация FDA одобрило препарат, Vorinostat, было сделано в течение двух недель после биопсии исходной ткани. Пациент был помещен на вориностат, что привело к успешному лечению заболевания 4.
Нормальная предстательная железа состоит из люминала, базальных и редких клеток нейроэндокринных 5. Просветными клетки образуют столбчатую эпителиальный слой железы и выражают рецептора андрогена (AR), а также другие маркеры, такие его стенке, как цитокератинам 8 и 18 и просостояние-специфического антигена (ПСА) 6. С другой стороны , базальные клетки локализованы под слоем полостной и выразить цитокератин 5 и p63, но низкие уровни AR 5. Мы 7, 8, 9 и другие 10 успешно использовали ЗПК простаты в доклинических механистических исследований чувствительности к лекарственным препаратам. Тем не менее, при выращивании в стандартных условиях 2D культуры ткани, эти клетки не в полной мере участвовать AR сигнализации 10. Важно отметить, что при помещении под почечную капсулу иммунодефицитных мышей ЗПК восстановили нормальную простату железистой архитектуру и функции указывает, что ЗПК простаты сохраняют свою коммитирование при размещении в разрешительном среде. Разработка фильтрующего элемента на основе системы клеточной культуры , описанной здесь , позволяет быстро (2 недели) дифференциацию ин витро ОЦР простаты, о чем свидетельствует бу увеличение экспрессии генов-мишеней AR и AR, а также снижение уровня p63.
Фильтрующие вставки, используемые содержат поликарбонатные мембраны (размер пор 0,4 мкм), которые могут поддерживать культивирование клеток млекопитающих. Система, как развивается, использует нормальных и злокачественных ОЦР простаты, 6-луночные культуры и фильтрующих вставок. Среды для культивирования клеток , обусловленные клетками J2 11 помещают в нижнюю камеру и простаты дифференцирующих сред в верхней камере. Описанные здесь методы поддерживают люминальную простаты дифференцировки клеток в течение 2-х недельного срока, в соответствии с целями персонализированной медицины. Кроме того, было необходимо разработать методики, которые позволяют комплексной молекулярной, генетической и клеточной профилирования культур. Подходы для выделения ДНК, РНК и белка из клеток высвобождается с поверхности фильтра, были разработаны и обтекаемый для обработки образцов точной повтора. FinaLLY, методология, необходимые для удаления фильтра, чтобы включить вложение, секционирования и для H & E, иммуногистохимических и иммунофлуоресцентного окрашивания, полностью описан.
Первичные клеточные линии являются важной и быстро развивающейся платформой для исследований рака. Культура вставки на основе 3D-система культуры поддерживает дифференциацию первичных ОЦР простаты в течение двух недель сроки. Метод фильтра CRC представляет собой новый метод, средний п…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Т32 (CA 9686-18) и TL1 (TL1TR001431) постдокторский грантов обучение наград (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), а также U01 PAR-12-095 (Kumar) и P30 CA051008-21 (Weiner). Пример фиксации, секционирования и окрашивание проводили в Lombardi Comprehensive Cancer Center гистологии и тканей совместно используемых ресурсов. Мы благодарим Ричарда Schlegel за полезные обсуждения. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения.
Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |