基于插入 - 滤池3D文化系统原发性前列腺细胞分化
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
有条件地重新编程细胞（CRC）的为原代细胞培养，并制定患者的细胞系广泛的“活生物银行”的能力，可持续发展的方法。对于许多类型的上皮细胞，各种三维（3D）培养的方法已经被描述了支持改进的分化状态。虽然结直肠癌保留他们的后裔承诺从他们被隔离的组织，他们无法在正常二维（2D）培养条件下生长，以表达许多与起源组织相关的分化标志。以增强患者来源CRC的前列腺癌研究中的应用，三维培养格式已被定义，它使一个快速（2周总）管腔细胞在正常和肿瘤衍生的前列腺上皮细胞的分化。这里，基于插入滤波器格式为正常和恶性前列腺CRC的培养和分化说明。一德提供的细胞收集和处理的免疫组化及免疫荧光染色所需的程序尾描述。总体描述的3D格式的文化，与主CRC线相结合，提供了重要的中期和高通量的模型系统基于生物样本前列腺的研究。
Introduction
这是个性化的个人识别和使用的癌症疗法在癌症研究的一个主要目标。最近，新的方法已经开发了允许在建立原代细胞培养物的更易于，潜在地同时提供识别和检验的个性化疗法的方法。例如，在基于R-脊椎前列腺类器官的方法1可用于三维（3D）正常和转移性前列腺癌的细胞在商业细胞外基质的培养（ 例如 ，基质胶），而细胞的有条件重新编程（CRC）的方法在乔治城2开发，利用3以上标准的2D培养条件。具体而言，Rho激酶抑制剂（Y-27632）和辐照J2小鼠成纤维细胞饲养细胞的组合导致角质形成细胞的CRC 2的无限期培养。在CRC的方法是极为坚固，与原代细胞系成功建立，并从前列腺和其他许多正常和恶性上皮组织3无限期地保持下去。重要的是，允许在谁没有一些以前的药物治疗的患者复发性呼吸道乳头状病原学基础的快速识别我们的CRC技术。此外，使用正常和肿瘤来源的CRC，FDA的成功鉴定批准的药物，伏立诺他，二周初始组织活检的内作出。病人被放置在伏立诺他，导致他们的疾病4的成功治疗。
正常的前列腺是由鲁米那，基底和罕见的神经内分泌细胞5。管腔细胞形成腺体的柱状上皮层和表达雄激素受体（AR），以及其他管腔标记物如角蛋白8和18和亲状态特定抗原（PSA）6。相反，基底细胞是局部管腔层下方，表达细胞角蛋白5和p63，但AR 5的低水平。我们7，8，9和其他10已成功地应用于前列腺康复中心在临床前机械药敏调查。然而，当标准的2D组织培养条件下生长，这些细胞不能完全啮合AR信令10。重要的是，当免疫缺陷小鼠的肾包膜下放置两个CRC恢复正常前列腺腺体结构和功能说明放置在一个宽容的环境，当前列腺康复中心保留其血统的承诺。此处所描述的基于插入滤波器的细胞培养系统的发展允许快速（2周） 在体外的前列腺CRC的分化所证明by中的Ar和Ar靶基因的表达增加以及降低p63的水平。
使用的过滤器插入件包含聚碳酸酯膜（孔径0.4微米），可支持的哺乳动物细胞的培养。该系统，为开发，利用正常的和恶性的前列腺康复中心，6孔培养皿和滤芯的。通过J2单元11调节的细胞培养基被放置在底室和前列腺区分媒体在顶室中。本文描述的技术支持2周的时间内前列腺管腔细胞分化，与个性化药物的目标相一致。它也必须开发出允许培养物的全面分子，遗传和细胞分析的方法。用于从过滤表面释放的细胞中分离DNA，RNA和蛋白质的方法已被开发并简化为准确重复样品的处理。菲娜LLY，需要取下过滤网，使嵌入，切片和H＆E，免疫组化及免疫荧光染色的方法，充分说明。
Protocol
Representative Results
Discussion
原代细胞系是癌症研究的一个重要的，迅速发展的平台。基于插入培养三维培养系统支持原发性前列腺CRC的为期两周的时间内的分化。该CRC滤波方法代表前列腺研究一个新的，中等吞吐量方法。现有鼠标PDX模型是耗时且极其昂贵，并且许多对PDX样品不能在培养物中生长，限制研究者发起实验和它们的用途。此外，同时建立PDX的成功率相差很大13中，CRC方法具有成功的建立细胞系<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由T32（CA 9686-18）和TL1（TL1TR001431）博士后培训给予奖励（LT），DOD PC140268（CA），W81XWH-13-1-0327（CA）TR000102-04（CA），以及支持U01 PAR-12-095（库马尔）和P30 CA051008-21（韦纳）。样品固定，切片和染色是在隆巴迪综合癌症中心的组织学与组织共享资源进行。我们感谢理查德·施莱格尔有益的讨论。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国家癌症研究所和美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
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