Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

Summary

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Abstract

células condicionalmente reprogramadas (CRCs) fornecer um método sustentável para a cultura de células primária e a capacidade de desenvolver extensas "biobancos viva" do paciente derivadas linhas celulares. Para muitos tipos de células epiteliais, várias abordagens de cultura tridimensionais (3D) foram descritos que suporta um estado diferenciado melhorada. Enquanto CRCs mantêm a sua linhagem compromisso para o tecido a partir do qual eles são isolados, eles não conseguem expressar muitos dos marcadores de diferenciação associados com o tecido de origem, quando cultivada sob duas condições de cultura dimensional (2D) normais. Para melhorar a aplicação dos CRCs derivadas de pacientes para pesquisa do câncer de próstata, um formato de cultura 3D foi definido que permite uma diferenciação celular rápida (2 semanas total) luminal em ambas as células epiteliais da próstata normais e derivadas de tumores. Nisto, um formato baseado no elemento filtrante é descrito para a cultura e a diferenciação dos dois CRCs normais e malignas da próstata. Um deA inscrição cauda dos procedimentos necessários para a coleta de células e processamento de coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência são fornecidos. Colectivamente o formato de cultura 3D descrito, combinados com as linhas CRC primárias, proporciona um médio importante destacar sistema modelo baseado em serviços para a pesquisa de próstata baseada biospecimen.

Introduction

A identificação e uso de terapias contra o câncer, que são personalizadas para os indivíduos são um objetivo principal na pesquisa do câncer. Recentemente, novas abordagens têm sido desenvolvidos para permitir uma maior facilidade no estabelecimento de culturas de células primárias, potencialmente proporcionando tanto meios de identificar e testar terapias personalizadas. Por exemplo, o da próstata com base em R-espondina abordagem organ�de ¹ permite tridimensional de cultura (3D) de células normais e metastáticas de cancro da próstata em uma matriz extracelular comercial (por exemplo, Matrigel), enquanto que o método da condicionalmente reprogramação das células (CRC) desenvolvido em Georgetown ^{2, 3} utiliza mais condições de cultura 2D padrão. Especificamente, a combinação de um inibidor da Rho cinase (Y-27632) e células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiadas conduzir à cultura indefinido de CRCs queratinócitos ^2. A metodologia é CRCextremamente robusta, com linhas de células primárias estabelecidas e mantidas indefinidamente a partir da próstata e muitos outros tecidos epiteliais normais e malignas ³ com sucesso. Importante, a nossa tecnologia de CRC permitido para a rápida identificação da base etiológica de papilomatose respiratória recorrente num doente que não tinha um número de tratamentos com drogas anteriores. Além disso, utilizando os CRCs normais e derivadas de tumores, a identificação bem sucedida de um fármaco aprovado pela FDA, vorinostat, foi feita no prazo de duas semanas de biópsia de tecido inicial. O paciente foi colocado na vorinostat, resultando no sucesso do tratamento da doença ^4.

A próstata normal é composta de luminal, basal e as raras células neuroendócrinas ^5. As células luminais formar a camada epitelial colunar da glândula e expressar o receptor de androgénio (AR), bem como outros marcadores tais como citoqueratinas luminais 8 e 18 e próantígeno específico de estado (PSA) ^6. Por outro lado, as células basais está localizada por baixo da camada luminal e expressa citoqueratinas 5 e p63, mas níveis baixos de AR ^5. Nós ^{7, 8, 9} e outros ¹⁰ têm usado com sucesso CRCs próstata em investigações sensibilidade a drogas mecanicistas pré-clínicos. No entanto, quando cultivada sob condições padrão de cultura de tecidos 2D, estas células não totalmente engatam AR sinalização ^10. Importantemente, quando colocada sob a cápsula renal de ratos imunodeficientes, o CRCs recuperou próstata arquitectura glandular normal e função, indicando que CRCs próstata conservam a sua linhagem compromisso quando colocado num ambiente permissivo. O desenvolvimento do sistema de cultura de células à base de inserção do filtro aqui descrito permite a rápida (2 semanas) a diferenciação in vitro de CRCs próstata como evidenciado by o aumento da expressão dos genes alvo de Ar e Ar, bem como uma diminuição dos níveis de p63.

Os elementos filtrantes utilizados contêm membranas de policarbonato (tamanho de poro, 0,4 uM) que podem suportar a cultura de células de mamíferos. O sistema, tal como desenvolvido, faz uso de CRCs próstata normais e malignas, 6 bem pratos de cultura e as inserções de filtro. Meios de cultura celular condicionado por células J2 ¹¹ é colocado na mídia de câmara e de próstata diferenciação de fundo na câmara superior. As técnicas descritas aqui apoiar diferenciação celular luminal de próstata dentro de um prazo duas semanas, de acordo com os objetivos da medicina personalizada. Foi também imperativo desenvolver as metodologias que permitem a caracterização molecular, genética e celular abrangente das culturas. Abordagens para isolamento de ADN, ARN e proteína de células libertadas a partir da superfície do filtro foram desenvolvidos e simplificado para o processamento de amostras de repetição exacta. Finally, a metodologia necessária para remover o filtro para permitir a incorporação, de corte e para a H & E, imuno-histoquímica e coloração de imunofluorescência, é totalmente descrito.

Protocol

1. Criação do celular 3D Cultura Inserir Sistema Coloque inserções de cultura de células 2 de policarbonato com uma orientação invertida (lado do filtro para cima) para baixo em uma placa de 6 poços (Figura 1A). Aplicar uma camada fina de 0,1% de gelatina em água, para o lado inferior da peça inserta e deixar secar (10-20 min) numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade. Repetir o passo 1.2 mais duas vezes para um total de 3 aplicações de 0…

Representative Results

O sistema de inserção de cultura de células com base é um procedimento relativamente simples e rápido para a produção de culturas em 3D de CRCs próstata que apoia a diferenciação celular luminal. Um diagrama esquemático do sistema é mostrado (Figura 1A) destacando a aplicação do revestimento de gelatina, para a superfície do fundo do elemento filtrante. As inserções são apenas virado para a aplicação da gelatina. Na Figura 1B, os filt…

Discussion

linhas de células primárias são uma plataforma importante e em rápido desenvolvimento para a investigação do cancro. O sistema de cultura 3D baseado em inserção de cultura apoia a diferenciação da CRCs próstata primários dentro de um prazo de duas semanas. O método do filtro CRC representa, um método de transferência novo meio para a investigação de próstata. Modelos existentes rato PDX são demorados e extremamente caro, e muitas das amostras PDX não podem ser cultivadas em cultura, o que limita a ex…

Materials

Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492