מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
תאים לתכנות מחדש מותנה (CRCs) לספק שיטת קיימא עבור תרבית תאים ראשונית ואת היכולת לפתח "biobanks חיים" הנרחב של שורות תאים שמקורם בחולה. עבור סוגים רבים של תאי אפיתל, שונות תלת ממדים (3D) גישות התרבות תואר התומכים מדינת בדיל השתפרה. בעוד CRCs לשמור מחויבות השושלת שלהם לרקמה שממנו הם מבודדים, הם לא מצליחים לבטא רבים של סמנים בידול הקשורים רקמות ממוצא כאשר גדל תחת נורמלי שני התנאים תרבות מימדי (2D). כדי לשפר את היישום של CRCs נגזרות החולות למחקר סרטן הערמונית, פורמט תרבות 3D הוגדר המאפשר בידול תא מהיר (2 שבועות סה"כ) לומינל בשני נורמלי גידולים שמקורם בתאי האפיתל ערמונית. בזאת, פורמט מבוסס כנס מסנן מתואר עבור culturing וההבחנה של שני CRCs ערמונית הנורמלי וממאירים. דהתיאור זנב של ההליכים הנדרשים לצורך איסוף תאים ועיבוד מכתים immunohistochemical ו immunofluorescent מסופקים. קולקטיבי בפורמט תרבות 3D תאר, בשילוב עם קווי CRC העיקריים, מספק בינוני חשוב גבוהה מערכת מודל תפוקה למחקר ערמונית מבוססת biospecimen.
Introduction
זיהוי והשימוש של טיפולים בסרטן שמותאם אנשים הם יעד מרכזי בחקר הסרטן. לאחרונה, גישות חדשות פותחו המאפשרות ביתר קל בהקמה בתרביות תאים ראשוניות, פוטנציאל לספק דרכים של שניהם זיהוי ובדיקת טיפולים אישית. לדוגמא, הערמונית מבוססת R-spondin גישת organoid 1 מאפשרת תלת ממדי (3D) culturing של תאי סרטן הערמונית נורמלים גרורתי בתוך תאי מטריקס מסחריים (למשל, Matrigel), בעוד Reprogramming המותנה של תאים (CRC) שיטה 2 שפותח בג'ורג'טאון, 3 מנצל תנאי תרבות 2D סטנדרטיים יותר. באופן ספציפי, השילוב של מעכבי קינאז Rho (Y-27632) ותאי מזין פיברובלסטים murine J2 מוקרן להוביל culturing בלתי מוגדר של CRCs keratinocyte 2. המתודולוגיה CRC היאמאוד חזק, עם שורות תאים ראשוניות הוקמו בהצלחה ומתוחזק ללא הגבלה זמן מהערמונית ורקמות אפיתל רגילות וממאירים רבים אחרות 3. חשוב לציין, טכנולוגית CRC שלנו מוותר עבור זיהוי המהיר של הבסיס אטיולוגי עבור papillomatosis נשימתיים חוזר אצל חולה אשר נכשל מספר הטיפולים התרופתיים קודמים. בנוסף, באמצעות CRCs נורמלי הנגזרות הגידול, זיהוי מוצלח של ה- FDA אישר תרופה, vorinostat, נעשתה תוך שבועיים מיום ביופסיה רקמות הראשונית. החולה הונח על vorinostat, וכתוצאה מכך הטיפול המוצלח של המחלה שלהם 4.
בלוטת הערמונית הנורמלית מורכבת הלומינל, הבזליים ותאי נוירואנדוקריניים הנדירים 5. תאי לומינל מהווים את שכבת האפיתל העמודים של הבלוטה ולהביע לקולטן האנדרוגן (AR), כמו גם סמנים לומינל אחרים כגון cytokeratins 8 ו -18 ופרוהמדינה אנטיגן ספציפי (PSA) 6. לעומת זאת, תאי הבזליים הם נקודות מתחת לשכבת לומינל ולהביע cytokeratin 5 ו p63, אבל רמות נמוכות של AR 5. אנחנו 7, 8, 9 ואחרים 10 השתמשו בהצלחה CRCs הערמונית בחקירות רגישות לתרופה מכניסטית פרה-קליניים. עם זאת, כאשר גדל בתנאים בתרבית רקמה 2D רגיל, תאים אלה אינם לגמרי לעסוק AR איתות 10. חשוב לציין, כאשר הניח תחת הקפסולה הכליות של עכברי immunodeficient, את CRCs שהעלה אדריכלות בלוטות נורמלית ערמונית ותפקוד מציין CRCs הערמונית לשמור שושלת מחויבותם כאשר הניח סביבת מתירנית. ההתפתחות של מסנן מערכת תרבית תאים להכניס המבוססת המתואר כאן מאפשרת המהירים (2 שבועות) במבחנת בידול של CRCs ערמונית כמו ב שמעידy הביטוי המוגבר של גני מטרת AR ו AR וכן הירידה ברמות של p63.
המחדיר המסנן הנמצא מכיל ממברנות פוליקרבונט (גודל נקבובי, 0.4 מיקרומטר) שיכול לתמוך culturing של בתאי יונקים. המערכת, שפותחה על, עושה שימוש CRCs ערמונית נורמלי וממאירים, 6 מנות תרבות היטב המחדירה המסנן. תרבית תאי תקשורת מותנית תאי J2 11 מושם בתקשורת ההבחנה קאמרית ערמונית התחתונה בתא העליון. הטכניקות המתוארות במסמך זה לתמוך התמיינות תאים luminal הערמונית בתוך פרק זמן 2 בשבוע, עולה בקנה אחד עם המטרות של רפואה אישית. זה היה גם הכרחי כדי לפתח מתודולוגיות המאפשרים פרופיל מולקולרי, גנטי ותאי המקיף של התרבויות. גישות לבידוד DNA, RNA וחלבון מתאי שוחרר מפני השטח המסנן פותחו יעיל לעיבוד מדגם חוזר מדויקת. פינהlly, המתודולוגיה הנדרשת להסרת המסנן כדי לאפשר הטמעה, חתך עבור H & E, immunohistochemical מכתים immunofluorescent, מתואר באופן מלא.
Protocol
Representative Results
Discussion
שורות תאים ראשיות הן פלטפורמה חשובה המתפתחת במהירות לחקר הסרטן. מערכת תרבות 3D תרבות מבוססת כנס תומכת הבידול של CRCs ערמונית העיקרי בתוך פרק זמן של שבועות. השיטה המסננת CRC מייצגת שיטת תפוקה חדשה, בינונית למחקר ערמונית. מודלי העכבר PDX קיימים הם זמן רב ויקר מאוד, ורבי דגימו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי T32 (CA 9686-18) ו TL1 (TL1TR001431) פרסים מענק עבודת הפוסט דוקטורט (שעון מקומי), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) וכן U01 PAR-12-095 (קומאר) ו P30 CA051008-21 (ויינר). קיבעון לדוגמא, חתך מכתים בוצע היסטולוגיה במרכז לחקר הסרטן לומברדי מקיף ואת המשאב המשותף רקמות. אנו מודים ריצ'רד שלגל לדיונים מועילים. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
