Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
Voorwaardelijk geherprogrammeerd cellen (CRC) een duurzame werkwijze voor primaire celkweek en het vermogen om grote "levende biobanken 'van patiënt afgeleide cellijnen te ontwikkelen. Voor veel soorten epitheliale cellen hebben verschillende driedimensionale (3D) cultuur benaderingen beschreven die een verbeterde gedifferentieerde toestand ondersteunen. Terwijl CRCs hun lineage inzet voor het weefsel waaruit ze worden geïsoleerd behouden, falen ze uit te drukken veel van de differentiatie markers in verband met het weefsel van herkomst wanneer gekweekt onder normale tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. De toepassing van patiënt afgeleide CRC voor prostaatkanker onderzoek te versterken, is een 3D cultuur format gedefinieerd die snel (2 weken totaal) luminale celdifferentiatie in normale en tumor-afgeleide prostaat epitheliale cellen mogelijk maakt. Hierin wordt een filterelement-gebaseerd formaat beschreven voor het kweken en differentiatie van normale en kwaadaardige prostaat CRC. A detailed beschrijving van de voor cellen en -verwerking zijn voor immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen worden voorzien. Gezamenlijk de 3D cultuur format beschreven, in combinatie met de primaire CRC lijnen, een belangrijk middellange doorvoer modelsysteem voor hoog- biospecimen gebaseerde prostate onderzoek.
Introduction
De identificatie en toepassing van kankertherapieën die op maat gemaakt kunnen individuen een hoofddoel in kankeronderzoek. Onlangs zijn er nieuwe benaderingen ontwikkeld die zorgen voor een grotere gemak bij het opzetten van primaire celculturen potentieel verschaffen leibanen van identificeren en testen gepersonaliseerde therapieën. Bijvoorbeeld, de R-spondin gebaseerde prostate organoïde benadering 1 zorgt voor driedimensionale (3D) het kweken van normale en metastatische prostaatkankercellen in commerciële extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel), terwijl de voorwaardelijk herprogrammeren van cellen (CRC) methode ontwikkeld aan Georgetown 2, 3 maakt gebruik van meer standaard 2D kweekomstandigheden. Met name de combinatie van een Rho kinase inhibitor (Y-27632) en bestraalde J2 murine fibroblast voedingscellen tot de onbepaalde kweken van keratinocyten CRC 2. De CRC methodologieextreem robuust, met primaire cellijnen met succes en voor onbepaalde tijd gehandhaafd van de prostaat en vele andere normale en kwaadaardige epitheliale weefsels 3. Belangrijker onze CRC technologie toegestaan voor de snelle identificatie van de etiologische basis voor terugkerend respiratoir papillomatose bij een patiënt die een aantal eerdere medicamenteuze behandelingen hadden gefaald. Voorts worden volgens normale en tumor afgeleide CRC, de succesvolle identificatie van een FDA goedgekeurde geneesmiddel, Vorinostat werd binnen twee weken na de initiële biopsie weefsel. De patiënt werd op vorinostat, waardoor de succesvolle behandeling van hun ziekte 4.
De normale prostaat bestaat uit luminale, basale en de zeldzame neuroendocriene cellen 5. Luminale cellen vormen de kolomvormige epitheellaag van de klier en drukken de androgeenreceptor (AR), en andere luminale merkers zoals cytokeratine 8 en 18 en prostate-specifiek antigeen (PSA) 6. Omgekeerd worden basale cellen gelokaliseerd onder de luminale laag en te uiten cytokeratine 5 en p63, maar lage niveaus van de AR 5. We 7, 8, 9 en 10 anderen hebben met succes gebruik prostate CRC's in preklinische mechanistische geneesmiddelgevoeligheid onderzoeken. Echter, wanneer gekweekt onder standaard 2D weefselkweekomstandigheden deze cellen niet volledig aangrijpen AR 10 signalering. Belangrijker nog, toen onder de renale capsule van immunodeficiënte muizen geplaatst, de CRC's weer normale prostaat klier architectuur en functie aan te geven dat de prostaat CRCs behouden hun lineage betrokkenheid bij plaatsing in een tolerante omgeving. De ontwikkeling van het filterelement gebaseerde celcultuur beschreven maakt de snelle (2 weken) in vitro differentiatie van prostate CRC zoals blijkt by de verhoogde expressie van de AR en AR doelwitgenen en verlaagde p63.
De filterpatronen gebruikt bevatten polycarbonaat membranen (poriegrootte 0,4 pm) die het kweken van zoogdiercellen kan ondersteunen. Het systeem, zoals ontwikkeld, maakt gebruik van normale en kwaadaardige prostaat CRC, 6 putjes en het filter inserts. Celkweekmedia J2 geconditioneerd door cellen 11 wordt in de onderste kamer en prostaatkanker differentiatie media in de bovenste kamer. De technieken die hierin beschreven ondersteunen prostaat lumen celdifferentiatie binnen een 2 week termijn, in overeenstemming met de doelstellingen van gepersonaliseerde geneeskunde. Het was ook noodzakelijk om de methoden waarmee de uitgebreide moleculaire, genetische en cellulaire profilering van de kweken te ontwikkelen. Werkwijzen voor het isoleren van DNA, RNA en eiwit uit cellen vrijgemaakt uit het filteroppervlak ontwikkeld en gestroomlijnd accurate tweede monster verwerking. Finally, de methodologie die nodig is voor het verwijderen van het filter om inbedding mogelijk te maken, snijden en voor H & E, immunohistochemische en immunofluorescentie kleuring, wordt volledig beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primaire cellijnen zijn een belangrijke en zich snel ontwikkelende platform voor kankeronderzoek. De cultuur insert-gebaseerde 3D-cultuur systeem ondersteunt de differentiatie van primaire prostaat CRCs binnen twee weken termijn. De CRC filter methode vertegenwoordigt een nieuwe, medium throughput methode voor prostaatkanker onderzoek. Bestaande muis PDX merken tijdrovend en zeer duur, en veel van de PDX monsters niet in kweek, beperken onderzoeker geïnitieerde experimenten en hun nut. Bovendien, terwijl slagingspercen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door T32 (CA 9686-18) en TL1 (TL1TR001431) postdoctorale opleiding subsidie awards (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), alsmede U01 PAR-12-095 (Kumar) en P30 CA051008-21 (Weiner). Monster fixatie, snijden en kleuring werd uitgevoerd in de Lombardi Comprehensive Cancer Center histologie en Tissue Shared Resource. Wij danken Richard Schlegel voor nuttige discussies. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
