Summary

Genoma-ancha análisis de inhibidor de HDAC mediada por modulación de microRNAs y mRNAs en células B inducida por recombinación del ADN someterse a interruptor de clase y diferenciación de células plasmáticas

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

Factores epigenéticos pueden interactuar con programas genéticos que modulan la expresión génica y regulan la función de la célula de B. Mediante la combinación de la estimulación in vitro de células B, qRT-PCR y alto rendimiento microARN-secuencia y secuencia de ARNm enfoques, podemos analizar la modulación epigenética de miRNA y expresión genética en las células de B.

Abstract

Respuestas de anticuerpos se logran a través de varios procesos críticos células B intrínsecos, incluyendo la hipermutación somática (SHM), la recombinación del ADN del interruptor de la clase (CSR) y diferenciación de la célula de plasma. En los últimos años, las modificaciones epigenéticas o factores, como la desacetilación de histonas y microRNAs (miRNAs), han demostrado interactuar con programas genéticos de células B en respuestas del anticuerpo forma, mientras que la disfunción de factores epigenéticos se ha encontrado para llevar a respuestas de autoanticuerpos. Análisis de expresión de miRNA y mRNA de genoma en las células B en respuesta a moduladores epigenéticos es importante para comprender la regulación epigenética de la célula de B función y anticuerpo respuesta. Aquí, demostramos un protocolo para la inducción de las células de B para someterse a la diferenciación de la RSE y la célula de plasma, tratar estas células B con inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) (IDH) y análisis de expresión de mRNA y microRNA. En este protocolo, se analizan directamente secuencias complementarias de ADN (cDNA) utilizando secuenciación de próxima generación ARNm (ARNm-seq) y tecnologías de miRNA-seq, mapeo de la secuencia se lee y el genoma, la transcripción reversa cuantitativa (qRT)-polimerización en cadena. Con estos planteamientos, hemos definido que, en las células de B inducidas a someterse a la RSE y la diferenciación de la célula de plasma, IDH, un regulador epigenético, selectivamente modula la expresión de miRNA y mRNA y altera la diferenciación de la RSE y la célula de plasma.

Introduction

Marcas epigenéticas o factores, como la metilación del ADN, modificaciones post-traduccionales de las histonas y RNAs no codificantes (incluyendo microRNA), modulan la función de la célula al alterar la expresión de gen1. Las modificaciones epigenéticas regulan la función de linfocitos B, como la recombinación del ADN de interruptor de la clase de inmunoglobulina (RSE), hipermutación somática (SHM) y diferenciación a células de memoria B o células plasmáticas, tal modo de modulación el anticuerpo y el autoanticuerpo respuestas2,3. RSE y SHM críticamente requieren desaminasa citidina inducida por activación (ayuda, codificado como Aicda), que es altamente inducida en las células B en respuesta a T dependientes y T independientes antígenos4. Las células de B clase-cambiar/hypermutated más diferencian en células plasmáticas, que secretan grandes cantidades de anticuerpos de una manera críticamente dependiente de la proteína de maduración inducida por linfocitos B 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)5. Cambios epigenéticos anormales en las células de B pueden resultar en respuestas del anticuerpo/autoanticuerpo aberrante, que pueden conducir a una respuesta alérgica o autoinmunidad1,4. Comprender factores como epigenéticos, como miRNAs, modular B célula-intrínsecas expresión génica no sólo es importante para el desarrollo de una vacuna, pero también es esencial para revelar los mecanismos de posibles respuestas de anticuerpo/autoanticuerpo anormal.

Desacetilación y acetilación de las histonas son modificaciones de los residuos de lisina de las proteínas histonas típicamente catalizadas por histona acetiltransferasa (HAT) e histona deacetilasa (HDAC). Estas modificaciones conducen a la accesibilidad creciente o decreciente de la cromatina y además permitan o evitar el atascamiento de proteínas o factores de transcripción al ADN y la alteración del gen expresión5,6, 7 , 8. inhibidores de las HDACS (IDH) son una clase de compuestos que interfieren con la función de las HDACs. Aquí, utilizamos el IDH (VPA) para abordar la regulación de las HDACS en el perfil de expresión genética intrínseca de las células B y en su mecanismo.

miRNAs son pequeños, no-codificación RNAs aproximadamente 18 a 22 nucleótidos de longitud que se generan a través de varias etapas. miRNA anfitrión genes se transcriben y forman la horquilla microRNA primario (pri-miRNAs). Se exportan al citoplasma, donde los pri-miRNAs más son transformados en miRNAs del precursor (pre-miRNAs). Finalmente, los miRNAs maduros se forman a través de la hendidura de la pre-miRNAs. miRNAs reconocer las secuencias complementarias dentro de lo 3′ región sin traducir de sus mRNAs blanco6,7. A través del silenciamiento postranscripcional, miRNAs regulan la actividad celular, como proliferación, diferenciación y apoptosis de10,11. Varios miRNAs puede apuntar el mismo ARNm, y un único miRNA puede potencialmente objetivo mRNAs múltiple, es importante tener una visión en el contexto del perfil de expresión de miRNA para entender el valor de la persona y el efecto colectivo de miRNAs. miRNAs han demostrado estar involucrados en el desarrollo de células B y diferenciación periférica, así como diferenciación de células B específicas de la etapa, respuesta de anticuerpos y autoinmunidad1,4,9. En el 3′ UTR de Aicda y Prdm1, hay varios sitios evolutivamente conservados validados o previsible que pueden ser objetivo de miRNAs8.

Modulación epigenética, incluyendo la modificación de la transcripción de las histonas y miRNAs, muestran un patrón de regulación específica de la etapa de tipo de la célula y la célula del gene expresión9. Aquí, describimos los métodos para definir la modulación mediada por los IDH de miRNA y expresión de mRNA, RSE y diferenciación de la célula de plasma. Estos incluyen protocolos para la inducción de las células B a la RSE y la diferenciación de la célula de plasma; para el tratamiento de las células B con IDH; y para el análisis de expresión de miRNA y mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq y mRNA-seq10,11,12,8,13.

Protocol

el protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de la atención institucional del Animal y los comités de uso de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio. 1. estimulación de B las células de ratón para RSC, diferenciación de la célula de Plasma y el tratamiento de HDI preparación de suspensiones celulares de bazo Nota: realizar todos los pasos en una campana de flujo laminar excepto ratón eutanasia y disección. E…

Representative Results

Usando nuestro protocolo, purificada de células B con LPS (3 μg/mL) e IL-4 (5 ng/mL) para 96 h puede inducir 30-40% de la RSE a la IgG1 y ~ 10% de la diferenciación de la célula de plasma. Después del tratamiento con HDI (500µM VPA), la RSE a IgG1 disminuyó a 10-20%, mientras que la diferenciación de la célula de plasma disminuyó a ~ 2% (figura 1). Inhibición mediada por el IDH de la RSE más fue confirmada por la disminuida cantidad de recombinación posterior…

Discussion

Este protocolo proporciona enfoques integrales para inducir el cambio de clase de la célula de B y la diferenciación de la célula de plasma; analizar sus efectos epigenéticos moduladores, es decir, IDH; y detectar el efecto del IDH en la expresión de mRNA y miRNA en estas células. La mayoría de estos enfoques puede utilizarse también para analizar el impacto del factor epigenético humano expresión de función y mRNA/miRNA de células B. Los enfoques de mRNA-seq/miRNA-seq y qRT-PCR también pueden utilizarse par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH 105813 AI y AI 079705 (para PC), la Alianza para la identificación de objetivos de investigación de Lupus en Lupus Grant ALR 295955 (para PC) y la investigación de la Fundación Nacional de investigación de la artritis otorga (en HZ). TS fue apoyado por el centro médico de Pediatría, Hospital de Xiangya segundo, Central South University, Changsha, China, en el marco del programa de visitas de Xiangya UT escuela de Medicina San Antonio estudiante de medicina.

Materials

C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific – Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

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Cite This Article
Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

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