Summary

マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna と遺伝子発現のエピジェネティックな変調を分析できます。

Abstract

抗体は、体性 hypermutation (SHM)、クラス スイッチ組換え DNA (CSR) およびプラズマ細胞の分化を含むいくつかの重要な B 細胞の本質的なプロセスを通じて実行されます。近年、エピジェネティック修飾やヒストン脱アセチル化とマイクロ Rna (Mirna) などの要因が後成の要因の機能不全につながる発見されました、図形抗体を B 細胞遺伝的プログラムと対話する示されています。自己抗体の応答。エピジェネティックな変調器への応答における B 細胞におけるゲノム マイクロ Rna と mRNA 発現解析は、B 細胞の機能と抗体の応答のエピジェネティック制御を理解することにとって重要です。ここでは、CSR と形質細胞に分化する B 細胞を誘導、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤 (定) とこれらの B セルを扱うマイクロ Rna と mRNA の発現解析のためのプロトコルを示す.このプロトコルで直接次世代 mRNA シーケンス (mRNA seq) と miRNA seq 技術、ゲノムおよび定量的逆転写 (qRT) 読み取り順序のマッピングを使用して相補的 DNA (cDNA) シーケンス分析-PCR。これらのアプローチで、CSR とプラズマ細胞分化を受ける B 細胞、HDI、エピジェネティックな調節選択的にマイクロ Rna と mRNA 発現を調節して CSR とプラズマ細胞分化を変更を定義しました。

Introduction

エピジェネティックなマークや、DNA のメチル化、ヒストン修飾、(マイクロ Rna を含む)、非コード Rna などの要因、遺伝子式1を変更することにより細胞機能を調節します。エピジェネティック修飾免疫グロブリン クラス スイッチ DNA 組換え (CSR)、体性 hypermutation (SHM)、メモリー B 細胞や形質細胞、抗体と自己抗体により変調への分化などの B リンパ球の機能を調節します。応答2,3。CSR SHM が高い T に依存し、T 独立した抗原4B 細胞に誘導される活性化誘導シチジン アデノシンデアミナーゼ (援助、 Aicdaとしてエンコード) が批判的に必要です。クラス スイッチ/hypermutated の B 細胞は 1 (Blimp1、 Prdm1としてエンコード)5大量の B リンパ球による成熟タンパク質に批判的に依存しての方法で抗体を分泌する形質細胞に分化します。B 細胞の異常なエピジェネティックな変化異常抗体/抗体応答は、アレルギー反応や自己免疫1,4につながる可能性があります。B 細胞の内因、Mirna などどの後成の要因を理解すると、調節遺伝子発現は、ワクチン開発のために重要ではないが、潜在的な異常抗体/抗体応答のメカニズムを明らかにすることも重要です。

ヒストンのアセチル化と脱アセチル化されてヒストンのアセチルトランスフェラーゼ (帽子) とヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 通常触媒を用いるヒストン蛋白質のリジン残基の変更。これらの変更をクロマチンの増加または減少のアクセシビリティにつながる、さらに許可または DNA と遺伝子発現5,6,の変質するトランスクリプション要因または蛋白質の結合を妨げる7,8. HDAC の抑制剤 (HDI)、hdacs をしたの機能を阻害する化合物のクラス。ここでは、B 細胞の本質的な遺伝子発現プロファイルとその機構上 HDAC の規制に対処するため HDI (バルプロ酸) を使用しました。

Mirna が小さく、非コード Rna 約 18 に 22 ヌクレオチド長でいくつかの段階を経て生成されます。miRNA 宿主遺伝子が書き換えられるとヘアピン プライマリ マイクロ Rna (Mirna-pri)。彼らは、pri Mirna が処理されてさらに Mirna 前駆体 (pre-Mirna) に細胞質にエクスポートされます。最後に、pre miRNAs の胸の谷間を経て成熟 Mirna が形成されます。miRNAs そのターゲット Mrna67の 3′ 非翻訳領域内の相補的なシーケンスを認識します。転写後サイレンシングは、miRNAs は、増殖・分化・ アポトーシスの1011などの細胞の活動を調節します。複数 miRNAs 同じ mRNA をターゲットすることができますので、1 つの単一のマイクロ Rna が複数の Mrna を対象可能性のある個々 の値は、miRNAs の集合的な効果を理解するマイクロ Rna 発現プロファイルのコンテキストのビューを持つことが重要です。miRNAs B 細胞の発達と周辺分化段階特異 B 細胞の分化、抗体応答、自己免疫1,4,9に関与することが示されています。3′ UTR AicdaPrdm1miRNAs8の対象にできるいくつか検証済みまたは予測の進化上保存されたサイトがあります。

エピジェネティックな変調では、ヒストンの転写後修飾および Mirna を含む遺伝子式9の細胞型と細胞の段階に特異的パターンを表示します。ここでは、我々 は miRNA と mRNA 発現、CSR およびプラズマ細胞の分化の HDI を介した変調を定義する方法を説明します。CSR と形質細胞分化を受ける B 細胞を誘導するためのプロトコルが含まれますHDI; と B 細胞を治療のためqRT PCR、seq、マイクロ Rna と mRNA seq1011,12,8,13マイクロ Rna と mRNA 発現を分析するため。

Protocol

プロトコルの制度的ケアとテキサス大学サンアントニオ校の利用委員会の動物のケアのガイドラインに従います。 1 CSR、プラズマ細胞分化、HDI 処理マウス B 細胞の刺激 脾臓細胞懸濁液の準備 注: マウスを除いて層流フードのすべての手順を実行します。安楽死と郭清。 、特定病原体フリー c57bl/6 j マウス (8-12 週齢) の CO 2 吸入に…

Representative Results

組合と B 細胞を浄化のプロトコルを使用して (3 μ g/mL) と IL-4 (5 ng/mL) の 96 h は IgG1 に CSR の 30-40%、形質細胞分化の ~ 10% を引き起こすことができます。プラズマ細胞の分化は ~ 2% に減少に 10-20% に低下した CSR IgG1 を HDI (バルプロ酸 500 μ m) と治療後 (図 1)。HDI 抑制する CSR のさらに後組換え Iμ Cγ1 と成熟した VHDJHの減少数によって確認され?…

Discussion

このプロトコルは、B 細胞クラス スイッチや形質細胞分化を誘導するために包括的なアプローチを提供します。エピジェネティックな変調、すなわち HDI; によってその影響を分析するにはこれらの細胞の mRNA および miRNA の表現に HDI の効果を検出します。これらのアプローチのほとんどは、ヒト B 細胞機能と mRNA/miRNA 発現の後成的要因の影響を分析する使用できます。定などのエピジェネテ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH 助成金 AI 105813 や AI 079705 (PC) に支えられた、(PC) にループス グラント ALR 295955 でループス研究ターゲット識別のための同盟および関節炎国立研究財団研究は (HZ) に付与します。TS は、xiangya の第 2 UT 医学サンアントニオ校の医学生の訪問プログラムのコンテキストで小児医療センター、第二 xiangya の第 3 病院、中央南大学、長沙、中国によって支えられました。

Materials

C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific – Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

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Cite This Article
Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

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