Summary

على نطاق الجينوم التحوير بوساطة "تحليل المانع هداك" ميكرورناس ومرناس في "ب الخلايا التي يسببها" للخضوع تبديل فئة جزئ الحمض النووي وتمايز خلية البلازما

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

عوامل جينية يمكن أن تتفاعل مع البرامج الوراثية لتعدل التعبير الجيني وتنظيم وظيفة الخلية ب. من خلال الجمع بين التحفيز في المختبر ب-الخلايا وقرة-بكر، والفائق microRNA-تسلسل ونهجا مرناً-تسلسل، يمكننا تحليل جينية تحوير التعبير ميرنا والجينات في الخلايا باء.

Abstract

يتم إنجاز استجابات الأجسام المضادة من خلال العديد من العمليات الحرجة الخلية ب-الذاتية، بما في ذلك هايبرموتيشن جسدية (SHM)، وتبديل فئة جزئ الحمض النووي (CSR)، وتمايز خلية البلازما. تم في السنوات الأخيرة، أظهرت تعديلات جينية أو عوامل مثل هيستون ديسيتيليشن وميكرورناس (ميرناس)، للتفاعل مع البرامج ب-الخلايا الوراثية لتشكيل جسم الاستجابات، بينما تم العثور على اختلال وظيفي لعوامل جينية تؤدي إلى استجابات الأجسام. تحليل التعبير على نطاق الجينوم ميرنا ومرناً في الخلايا ب ردا على المغيرون جينية مهم لفهم تنظيم استجابة الدالة وجسم ب-خلية جينية. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لحفز الخلايا ب الخضوع للتمييز بين المسؤولية الاجتماعية للشركات، وخلايا البلازما، علاج هذه الخلايا ب مع مثبطات هيستون deacetylase (هداك) (دعم)، وتحليل التعبير مرناً وميكرورنا. في هذا البروتوكول، نحن نحلل مباشرة مكملة تسلسل الحمض النووي (كدنا) استخدام تكنولوجيات seq ميرنا، والجيل المقبل مرناً التسلسل (مرناً-seq) يقرأ تعيين تسلسل الجينوم، وكمية النسخ العكسي (قرة)-بكر. مع هذه النهج، حددنا في الخلايا ب الناجمين عن الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلايا البلازما، المبادرة، منظم جينية، بشكل انتقائي ينظم التعبير ميرنا ومرناً ويغير تمايز خلية البلازما والمسؤولية الاجتماعية للشركات.

Introduction

علامات جينية أو عوامل، مثل التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال مثلايشن الحمض النووي والكشف غير الترميز (بما في ذلك ميكرورناس)، تعدل وظيفة الخلية بتغيير التعبير الجيني1. تعديلات جينية تنظيم وظيفة باللمفاويات، مثل جزئ الحمض النووي تبديل الطبقة الغلوبولين المناعي (CSR)، هايبرموتيشن جسدية (SHM) والتمايز إلى خلايا الذاكرة ب أو خلايا البلازما، وبالتالي تحوير بجسم والأجسام الردود2،3. المسؤولية الاجتماعية للشركات و SHM خطيرة تتطلب ديامينان سيتيديني التي يسببها التنشيط (المعونة، ترميز كأيكدا)، الذي هو الناجم عن درجة عالية في الخلايا ب استجابة لتعتمد على T والمستقلة T المستضدات4. الفئة-تحولت/هايبرموتاتيد ب خلايا أخرى تفرق في خلايا البلازما، التي تفرز كميات كبيرة من الأجسام المضادة بطريقة يتوقف بصورة حاسمة على البروتين نضوج المستحثة اللمفاويات ب 1 (Blimp1، ترميز ك Prdm1)5. قد يؤدي تغييرات جينية غير طبيعي في الخلايا ب استجابات جسم/الأجسام الشاذة، التي يمكن أن تؤدي إلى استجابة الحساسية أو المناعة الذاتية1،4. فهم عوامل جينية كيف، مثل ميرناس، تعدل الخلية ب-الذاتية التعبير الجيني ليس هاما لتطوير اللقاحات، ولكن ضروري أيضا للكشف عن آليات استجابات جسم طبيعي/الأجسام المحتملة.

هيستون acetylation وديسيتيلاتيون بتعديلات مخلفات يسين على البروتينات هستون عادة ما تحفزها acetyltransferase هستون (هات) و deacetylase هيستون (هداك). هذه التعديلات تؤدي إلى إمكانية الوصول إلى تزايد أو تناقص من الكروماتين وكذلك السماح أو منع ربط عوامل النسخ أو البروتينات للحمض النووي وتحوير الجينات التعبير5،6، 7 , 8-مثبطات هداك (المبادرة) هي فئة من المركبات التي تتداخل مع وظيفة هداكس. هنا، نحن تستخدم المبادرة (جيش فيتنام الشعبي) لمعالجة تنظيم هداك الشخصية التعبير الجيني الجوهرية من خلايا ب وآليتها.

ميرناس هي الصغيرة، غير الترميز الكشف ما يقرب من 18 إلى 22 النيوكليوتيدات في المدة التي يتم إنشاؤها من خلال عدة مراحل. ميرنا المضيفة جينات يتم نسخها وشكل دبوس ميكرورناس الأولية (pri-ميرناس). أنها تصدر إلى السيتوبلازم، حيث تتم معالجة pri-ميرناس كذلك إلى السلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس). وأخيراً، تتشكل ميرناس ناضجة من خلال الانقسام من قبل–ميرناس. ميرناس الاعتراف بتسلسل التكميلية داخل المنطقة 3 ‘ غير مترجمة على6،مرناس الهدف7. من خلال إسكات بوستترانسكريبشونال، ميرناس تنظيم النشاط الخلوي، مثل انتشار، والتمايز، والمبرمج10،11. منذ ميرناس متعددة يمكنك استهداف نفس مرناً، وميرنا واحد واحد يمكن أن يحتمل أن تستهدف مرناس متعددة، من المهم أن يكون رأياً في سياق تعريف التعبير ميرنا لفهم قيمة الفرد والجماعية أثر ميرناس. ميرناس أظهرت أن تشارك في التنمية ب-الخلية والتمايز هامشية، فضلا عن ب-الخلية الخاصة بمرحلة التمايز واستجابة الأجسام المضادة والمناعة الذاتية1،،من49. في 3 ‘ UTR أيكدا و Prdm1، هناك عدة مواقع تقحم المصانة تم التحقق من صحتها أو المتوقعة التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل ميرناس8.

تعديل جينية، بما في ذلك التعديل بعد انتهاء النسخ هيستون وميرناس، عرض نمط لائحة الخاصة بالمرحلة من نوع الخلية والخلية من التعبير الجيني9. هنا، يمكننا وصف أساليب لتحديد تعديل المبادرة بوساطة ميرنا والتعبير مرناً والمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما. وتشمل هذه البروتوكولات لحفز خلايا ب الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلية البلازما؛ لعلاج الخلايا ب مع مبادرة التنمية البشرية؛ ومن أجل تحليل التعبير ميرنا ومرناً ببكر قرة وميرنا seq seq مرناً10،11،12،،من813.

Protocol

البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية “مؤسسات الرعاية الحيوانية” و “استخدام اللجان التابعة” لجامعة تكساس مركز علوم الصحة في سان أنطونيو. 1. “تحفيز الخلايا ب الماوس” للمسؤولية الاجتماعية للشركات، والتمايز خلية البلازما، ومعاملة المبادرة إعداد تعليق خلية…

Representative Results

استخدام لدينا بروتوكول، تنقية الخلايا ب وضعها مع لبس (3 ميكروغرام/مل)، وايل-4 (5 نانوغرام/مل) ليمكن أن يستحث ح 96 30-40 ٪ من المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 و ~ 10% من تمايز خلية بلازما. بعد العلاج مع المبادرة (500µM جيش فيتنام الشعبي)، المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 انخفض إ?…

Discussion

يوفر هذا البروتوكول نهج شاملة للحث على تبديل فئة بالخليه وتمايز خلية البلازما؛ لتحليل تأثيرها بجينيه المغيرون، إلا وهي مبادرة التنمية البشرية؛ والكشف عن أثر المبادرة على التعبير مرناً وميرنا في هذه الخلايا. معظم هذه النهج يمكن استخدامها أيضا لتحليل تأثير عوامل جينية في التعبير الدالة و?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة منح 105813 منظمة العفو الدولية ومنظمة العفو الدولية 079705 (على الكمبيوتر)، التحالف من أجل “تحديد الهدف البحث الذئبة” في الذئبة 295955 ALR المنح (للكمبيوتر)، والبحوث “مؤسسة أبحاث التهاب المفاصل الوطنية” منح (هرتز). وأيد المركز الطبي لطب الأطفال، مستشفى إكسيانجيا الثانية، وجامعة جنوب وسط مدينة تشانغشا، الصين، في سياق برنامج الزيارة طالب طب إكسيانجيا-يوتا “مدرسة طب سان أنطونيو” TS.

Materials

C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific – Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

References

  1. Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
  2. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
  3. Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
  4. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
  5. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
  6. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  7. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
  8. White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
  9. Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
  10. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
  11. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
  12. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
  13. Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
  14. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
  15. Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
  17. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  18. Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).

Play Video

Cite This Article
Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

View Video