Summary

Modulation de génome induite par l’analyse des HDAC inhibiteur des microARN et ARNm dans B cellules amenées à soumises classe-commutateur de recombinaison de l’ADN et la différenciation des cellules de Plasma

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

Des facteurs épigénétiques peuvent interagir avec les programmes génétiques de moduler l’expression des gènes et de réguler la fonction des cellules B. En combinant la stimulation in vitro de cellules B, qRT-PCR et haut débit micro-ARN-séquence et ordre d’ADN messagère approches, nous pouvons analyser la modulation épigénétique de miRNA et l’expression génique dans les cellules de B.

Abstract

Production d’anticorps est effectuées par plusieurs processus intrinsèques critique les lymphocytes B, dont le hypermutation somatique (SHM), classe-commutateur de recombinaison de l’ADN (RSE) et la différenciation des cellules de plasma. Ces dernières années, les modifications épigénétiques ou des facteurs tels que la désacétylation des histones et microARN (miARN), ont démontré d’interagir avec les programmes génétiques de cellules B pour la production d’anticorps forme, tandis que le dysfonctionnement des facteurs épigénétiques a été trouvé pour conduire à réponses d’auto-anticorps. Analysant le génome-large ARNm et miRNA expression dans les lymphocytes B en réponse aux modulateurs épigénétiques est importante pour comprendre la régulation épigénétique de la réponse anticorps et la fonction des lymphocytes B. Ici, nous démontrons un protocole pour induire des cellules B subissent une différenciation RSE et plasmocyte, traitant ces cellules B avec inhibiteurs d’histone désacétylase (HDAC) (IDH) et analyser l’expression d’ARNm et de micro-ARN. Dans ce protocole, nous analysons directement des séquences d’ADN (cDNA) complémentaires à l’aide de séquençage d’ADN messagère nouvelle génération (ARNm-seq) et technologies de miRNA-seq, cartographie du séquençage lit au génome et transcriptase inverse quantitative (qRT)-PCR. Avec ces approches, nous avons défini que, dans les cellules de B amenées à subir la RSE et la différenciation des cellules de plasma, HDI, un régulateur de l’épigénétique, sélectivement module l’expression de l’ARNm et miRNA et altère la différenciation RSE et plasmocyte.

Introduction

Marques épigénétiques ou facteurs tels que la méthylation de l’ADN et ARN non codants (y compris les microARN), modifications post-traductionnelles histone modulent la fonction des cellules en modifiant l’ expression de gène1. Modifications épigénétiques régulent la fonction des lymphocytes B, tels que la recombinaison de l’ADN-l’interrupteur de la classe immunoglobuline (RSE), hypermutation somatique (SHM) et la différenciation de cellules B mémoire ou plasmocytes, modulant ainsi les anticorps et les auto-anticorps réponses2,3. RSE et SHM critique nécessitent déaminase cytidine induite par l’activation (aide, codé comme Aicda), qui est fortement induite dans les cellules en réponse à T-dépendante et d’antigènes T-indépendants4B. Cellules de B classe-commuté/hypermutated encore différencient en plasmocytes, qui sécrètent de grandes quantités d’anticorps de façon critique dépendante de la protéine induite par le lymphocyte B maturation 1 (Blimp1, codé comme Prdm1)5. Les changements épigénétiques anormaux dans les cellules de B peuvent entraîner des réponses anticorps/auto-anticorps aberrants, qui peuvent conduire à une réaction allergique ou d’auto-immunité1,4. Comprendre comment épigénétiques facteurs, tels que les miARN, moduler intrinsèques cellules B l’expression des gènes n’est pas seulement importante pour le développement de vaccins, mais il est également essentielle de révéler les mécanismes de réactions anticorps anormaux/auto-anticorps potentielles.

Désacétylation et l’acétylation des histones sont des modifications des résidus lysine sur histones généralement catalysées par acétyltransférase d’histone (HAT) et histone désacétylase (HDAC). Ces modifications conduisent à l’accessibilité croissante ou décroissante de la chromatine et encore autoriser ou empêchent la fixation de facteurs de transcription ou des protéines à l’ADN et l’altération du gène expression5,6, 7 , 8. inhibiteurs d’HDAC (HDI) sont une classe de composés qui interfèrent avec la fonction de HDACs. Ici, nous avons utilisé le HDI (APV) d’aborder la réglementation des HDAC sur le profil d’expression génique intrinsèque des cellules B et sur son mécanisme.

miARN est petites, non codantes RNAs environ 18 à 22 nucléotides de longueur qui sont générés par plusieurs étapes. miRNA hôte gènes sont transcrits et forment en épingle à cheveux microARN primaire (pri-miARN). Ils sont exportés vers le cytoplasme, où les pri-miARN est transformés en précurseur miARN (pré-miARN). Enfin, les miARN matures est formés par le clivage de la pré-miARN. miARN reconnaître les séquences complémentaires dans la région 3′ non traduite de leurs cibles ARNm6,7. Par le biais de silence post-transcriptionnelle, miRNAs réguler l’activité cellulaire, tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose10,11. Étant donné que plusieurs miARN peut cibler le même ARNm, et un seul miRNA peut potentiellement cibler plusieurs ARNm, il est important d’avoir une vue dans le contexte du profil de l’expression de miRNA pour comprendre la valeur de l’individu et l’effet combiné des miARN. miARN ont été démontré d’être impliqués dans le développement des cellules B et différenciation des périphérique, ainsi que différenciation des lymphocytes B spécifiques au stade, réaction immunitaire et auto-immunité1,4,9. Dans la région 3′ UTR de Aicda et Prdm1, il y a plusieurs sites évolutivement conservés validés ou prévisible pouvant être ciblées par les miARN8.

Modulation épigénétique, y compris la modification post-transcriptionnelle d’histone et miARN, afficher un modèle de règlement spécifique au stade de type cellulaire et cellules de gene expression9. Nous décrivons ici les méthodes pour définir la modulation induite par l’IDH de miRNA et expression ARNm, la RSE et la différenciation des cellules de plasma. Il s’agit de protocoles permettant d’induire des cellules B à subir la RSE et la différenciation des cellules de plasma ; pour traiter les cellules B avec HDI ; et pour analyser l’expression de l’ARNm et miRNA par qRT-PCR, miRNA-seq et ARNm-seq10,11,12,8,13.

Protocol

le protocole suit les directives de protection des animaux de l’Institutional Animal soins et utilisation des comités de l’Université du Texas Health Science Center à San Antonio. 1. stimulation de cellules B de souris pour la RSE, la différenciation des cellules de Plasma et le traitement de HDI préparation des suspensions de cellules de rate Remarque : Exécutez toutes les étapes dans une hotte à flux laminaire à l’exception de la souris l’…

Representative Results

En utilisant notre protocole, purifié des cellules B placés au LPS (3 µg/mL) et IL-4 (5 ng/mL) pour 96 h peut induire des 30 à 40 % de la RSE à IgG1 et environ 10 % de la différenciation des cellules de plasma. Après le traitement avec l’IDH (500µM APV), la RSE à IgG1 a diminué de 10 à 20 %, tandis que la différenciation des cellules de plasma a diminué à environ 2 % (Figure 1). Inhibition de la RSE par HDI a été confirmée par une diminution après reco…

Discussion

Ce protocole prévoit des approches globales pour induire la commutation de classe B cellulaire et la différenciation des cellules de plasma ; d’analyser leur impact par des modulateurs épigénétiques, nommément HDI ; et pour détecter l’effet du HDI sur l’expression de l’ARNm et miRNA dans ces cellules. La plupart de ces approches permet également d’analyser l’impact des facteurs épigénétiques sur expression humaine de B-cellule fonction et ARNm/miRNA. Les qRT-PCR et les approches de l’ARNm-seq/m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les NIH subventions 105813 AI et AI 079705 (pour PC), l’Alliance pour l’Identification des cibles recherche Lupus dans le Lupus Grant ALR 295955 (pour PC) et la recherche de l’arthrite National Research Foundation accorde (à HZ). TS a été soutenu par le centre médical de pédiatrie, Université de South Central, seconde Xiangya hôpital, Changsha (Chine), dans le cadre du programme visite Xiangya-UT l’école de médecine San Antonio étudiant en médecine.

Materials

C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific – Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

References

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Cite This Article
Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

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