Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas
Summary
Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.
Abstract
Respostas de anticorpos são realizadas através de vários processos, células B crítico-intrínseca, incluindo somática (SHM), recombinação de DNA de classe-switch (RSE) e diferenciação de células plasmáticas. Nos últimos anos, modificações epigenéticas ou fatores, tais como deacetilação de histona e microRNAs (miRNAs), têm sido mostrados para interagir com os programas genéticos de células B a respostas de anticorpos de forma, enquanto a disfunção dos fatores epigenéticos foi encontrada para conduzir a respostas de auto-anticorpos. Analisando a expressão de miRNA e mRNA de todo o genoma em células B em resposta a epigenéticas moduladores é importante para compreender a regulação epigenética da célula B função e anticorpo resposta. Aqui, demonstramos um protocolo para indução de células B submeter-se a diferenciação de RSE e células plasmáticas, tratando estas células B com inibidores de histona deacetilase (HDAC) (IDHs) e analisando a expressão do mRNA e microRNA. Neste protocolo, analisamos diretamente complementares sequências de DNA (cDNA) usando sequenciamento de mRNA de próxima geração (seq-mRNA) e tecnologias de miRNA-seq, mapeamento do sequenciamento lê ao genoma e quantitativa (qRT) a transcrição reversa-PCR. Com estas abordagens, definimos que, em células B induzidas a se submeter a RSE e diferenciação de células plasmáticas, HDI, um regulador epigenético, seletivamente modula a expressão miRNA e mRNA e altera a diferenciação de RSE e células plasmáticas.
Introduction
Marcas epigenéticas ou fatores, como a metilação do DNA e RNA não-codificante (incluindo microRNAs), posttranslational modificações do histone modulam a função celular, alterando a expressão de gene1. Modificações epigenéticas regulam a função de linfócitos B, tais como recombinação de DNA de classe-interruptor de imunoglobulina (RSE), somática (SHM) e diferenciação de células B de memória ou pilhas de plasma, desse modo, modulando o anticorpo e auto-anticorpos respostas de2,3. RSE e SHM criticamente exigem deaminase citidina induzida por ativação (auxílio, codificado como Aicda), que é altamente induzida em células B em resposta ao T-dependentes e T-independentes antígenos4. As células B classe-comutado/hypermutated mais se diferenciar em plasmócitos, que secretam grandes quantidades de anticorpos de forma criticamente dependente da proteína de maturação de linfócitos B-induzido 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)5. Mudanças epigenéticas anormais nas células B podem resultar em respostas de anticorpo/auto-anticorpos aberrante, que podem levar à resposta alérgica ou auto-imunidade1,4. Compreendendo fatores como epigenéticas, tais como os miRNAs, modulam célula B-intrínseca expressão gênica não é apenas importante para o desenvolvimento de vacina, mas também é essencial para revelar os mecanismos de respostas potenciais de anticorpo/auto-anticorpos anormais.
Deacetilação e acetilação da histona são modificações dos resíduos de lisina em proteínas histonas normalmente catalisadas por histona acetiltransferase (chapéu) e histona deacetilase (HDAC). Estas modificações levam à acessibilidade crescente ou decrescente da cromatina e, ainda mais, permitam ou impedem a ligação de fatores de transcrição ou proteínas ao DNA e a alteração do gene expressão5,6, 7 , 8. inibidores HDAC (IDH) são uma classe de compostos que interferem com a função das HDACs. Aqui, usamos HDI (VPA) para abordar o Regulamento de HDAC sobre o perfil de expressão de gene intrínseca das células B e seu mecanismo.
os miRNAs são pequenos, não-codificantes RNAs aproximadamente de 18 a 22 nucleotídeos de comprimento que são gerados por vários estágios. miRNA anfitrião genes são transcritos e formam o grampo principal microRNAs (miRNAs-pri). São exportados para o citoplasma, onde pri-miRNAs são subsequentemente transformados em miRNAs precursor (pre-miRNAs). Finalmente, formam-se através da segmentação dos pre-miRNAs miRNAs maduros. os miRNAs reconhecer as sequências complementares dentro da região 3′ untranslated do seu alvo mRNAs6,7. Através do silenciamento pós-transcricional, miRNAs regular a atividade celular, tais como a proliferação, diferenciação e apoptose10,11. Já vários miRNAs podem direcionar o mesmo mRNA, e um único miRNA potencialmente pode direcionar vários mRNAs, é importante ter uma visão do contexto do perfil de expressão de miRNA para compreender o valor do indivíduo e o efeito conjugado dos miRNAs. os miRNAs foram mostrados para ser envolvido no desenvolvimento de células B e diferenciação periférica, bem como diferenciação de estágio específico de células B, resposta imunitária e auto-imunidade1,4,9. Na 3′ UTR de Aicda e Prdm1, existem vários validados ou previsível evolutivamente conservadas sites que podem ser direcionados por miRNAs8.
Modulação epigenética, incluindo modificação pós-transcrição de histona e miRNAs, exibir um tipo de célula e célula padrão de regulamento de estágio específico do gene expressão9. Aqui, descrevemos os métodos para definir a modulação mediada por HDI de miRNA e expressão do mRNA, CSR e diferenciação de células plasmáticas. Estes incluem protocolos para indução de células B submeter-se a RSE e diferenciação de células plasmáticas; para tratar as células B com IDH; e para analisar a expressão miRNA e mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece abordagens globais para induzir a comutação de classe B célula e diferenciação de células plasmáticas; para analisar o seu impacto por moduladores epigenéticos, ou seja, IDH; e para detectar o efeito de IDH na expressão do mRNA e miRNA nestas células. A maioria dessas abordagens também pode ser usada para analisar o impacto do factor epigenética na expressão de função e mRNA/miRNA B-célula humana. O qRT-PCR e mRNA-seq/miRNA-seq abordagens também podem ser usadas para analisar as c?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 105813 AI e AI 079705 (para PC), a Aliança para identificação de alvo de pesquisa de Lúpus no lúpus Grant ALR 295955 (para PC) e a pesquisa da artrite National Research Foundation concedem (a HZ). TS foi apoiado pelo centro médico de Pediatria, segundo Xiangya Hospital, Universidade de South Central, Changsha, China, no contexto do programa visita Xiangya-UT escola de medicina, San Antonio de estudante de medicina.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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