This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
El mantenimiento de la integridad sección de la planta es esencial para el estudio de las estructuras anatómicas detalladas en el celular, tisular, o incluso a nivel de órganos. Sin embargo, algunas células vegetales tienen paredes celulares rígidas, fibras duras y cristales (oxalato de calcio, sílice, etc.), y alto contenido de agua que a menudo interrumpen la integridad del tejido durante el corte del tejido de la planta.
Este estudio establece un método simple de seccionar el tejido híbrido-Cut. Este protocolo modifica una técnica de corte a base de parafina y mejora la integridad de secciones de tejido de diferentes plantas. Los tejidos vegetales fueron incluidos en parafina antes de seccionar en un criostato a -16 ° C. Seccionar a baja temperatura endureció el bloques de parafina, la reducción de rasgado y el rascado, y mejoró significativamente la integridad del tejido. Este protocolo se aplicó con éxito a los tejidos Phalaenopsis orquídeas ricos en oxalato de calcio, así como tejidos recalcitrantes tales como orga reproductivans y hojas de arroz, maíz y trigo. Además, la alta calidad de secciones de tejido de Hybrid-Cut podría ser utilizado en combinación con hibridación in situ (ISH) para proporcionar los patrones de expresión espacial de genes de interés. En conclusión, este protocolo es particularmente útil para el tejido vegetal que contiene recalcitrante alto contenido de sílice cristalina o. secciones de tejido de buena calidad permiten a los estudios biológicos y morfológicos otros.
El método de corte a base de parafina es una técnica ampliamente utilizada para estudios anatómicos. La preservación de la anatomía del tejido intacto es importante para los estudios morfológicos y biológicos. La técnica de corte incluido en parafina es ventajoso porque de inclusión en parafina conserva la morfología celular y tisular. Además, los bloques de parafina se pueden almacenar convenientemente durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, seccionamiento embebido en parafina no es adecuado para los tejidos vegetales que contienen cristales intracelulares. Cristales dentro de las células a menudo rasgan las cintas de parafina y la integridad del tejido daños durante el corte.
A diferencia de seccionamiento de parafina, cryosectioning es relativamente rápido y secciones se puede obtener sin la fijación, deshidratación serial o incrustación de infiltración medio 1. Criosecciones son compatibles con muchas aplicaciones tales como inmunohistoquímica, hibridación in situ, y la histoquímica enzimática. La otra ventaja de cryosectioning esque este método no pasa por un potencial de los procesos de desnaturalización como de alta temperatura y tratamientos químicos, moléculas de modo celulares están bien conservados dentro de las secciones de tejido 2. Cryosectioning se prefiere generalmente sobre base de parafina de seccionamiento para estudios en los tejidos animales. Sin embargo, cryosectioning no es la primera opción en las plantas debido a la temperatura de congelación a veces provoca la formación de cristales de hielo que afectan a la calidad de la sección de integridad. Aunque la osmorregulación tales como soluciones de sacarosa, polietilenglicol (PEG), o glicerol 3 han sido reportados para reducir la formación de cristales de hielo en condiciones de congelación, la mejora es menos que óptima.
Para adaptarse a diferentes entornos, diferentes plantas a menudo tienen células textura del tejido y de plantas distintas han evolucionado para formar las paredes rígidas de células, fibras duras, y los cristales de 4,5. Por ejemplo, los cristales de oxalato de calcio insolubles y cuerpos de sílice son bastante comunes en6 plantas. Cuerpos de silicato / cristales se han reportado para ayudar a mantener la arquitectura de planta, erectos, y prevenir la enfermedad o plaga de plantas de cereales 7-9.
Las orquídeas en maceta y el mercado de la orquídea de flores cortadas está floreciendo y es una industria en crecimiento. Phalaenopsis aphrodite (orquídea de polilla) es una de las plantas ornamentales de exportación más importantes de Taiwán. Se han hecho esfuerzos significativos para comprender los cambios morfológicos y fisiológicos de los procesos de floración de las orquídeas Phalaenopsis. Espigas florales de orquídeas Phalaenopsis se inician a partir de yemas axilares en la base de la hoja. Después de un período de temperatura ambiente fresco (aproximadamente un mes y medio), yemas axilares se agrandan, romper la latencia y sobresalir de la base de la hoja de convertirse en espigas florales jóvenes. Para entender la fisiológica, celular, y los procesos moleculares de iniciación de la espiga, es esencial desarrollar una técnica anatómica robusto para visuaLize tejidos o marcadores en el momento oportuno. Sin embargo, la presencia de cristales omnipresentes en los tejidos de orquídeas, sobre todo en las yemas axilares, hace que el trabajo anatómico difícil.
Aquí hemos tratado de mejorar la sección de la integridad de los tejidos vegetales recalcitrantes que han sido considerados hasta ahora como un desafío técnico. Aquí se muestra un protocolo mejorado llamado Hybrid-Cut. Es un método de corte a base de parafina que se realiza usando un criostato. la inclusión en parafina resuelve alto contenido de agua en el tejido vegetal. Seccionar a baja temperatura endurece el bloque de parafina, reduce cristal desgarro problema, y mejora significativamente la integridad del tejido. Este protocolo mejora significativamente la integridad del tejido para muestras de plantas recalcitrantes.
Las células vegetales tienen paredes rígidas de células, fibras duras, cristales y alto contenido de agua que causan problemas de desgarro de tejido durante el corte de tejidos vegetales. A pesar de seccionamiento a base de parafina se utiliza con frecuencia para tejidos de la planta, los cristales endógenos menudo laceran el tejido de la planta durante el corte (Figura 1). Debido a la inherentemente alto contenido de agua dentro de las células de la planta, de corte a base de criostato a menudo hace que las células rotas y las secciones de tejido agrietados.
En el presente estudio, un protocolo de inclusión en parafina y cryosection combinado llamado Hybrid-Cut se desarrolló y se obtuvieron buenos cortes de tejidos de calidad. Este protocolo resuelve el problema asociado con alto contenido de agua mediante la introducción de la inclusión en parafina, y reduce el efecto de rasgado por el endurecimiento de la cera de parafina en condiciones de baja temperatura durante el corte (Figura 3). Por lo tanto, este protocolo modificado es ventajosa sobre cualquiera secció a base de parafinaNing o cryosectioning para preservar la integridad del tejido vegetal.
Este manuscrito demuestra que el método híbrido-Cut preserva la integridad del tejido en muchos tejidos del Phalaenopsis orquídea tales como yema axilar, semilla, y PLB, etc. que contienen altos niveles de cristales (Figuras 3-4). Por otra parte, este protocolo es susceptible de cultivos de cereales tales como órganos reproductivos y las hojas de arroz, el maíz y el trigo, que contienen alta de sílice (Figuras 5-6). Presumiblemente, este protocolo se puede aplicar a las plantas leñosas que contienen alto contenido de fibra.
En general, el tejido que se fijan a fondo es muy importante para Hybrid-Cut. Hemos encontrado que el ácido de formaldehído-alcohol-ácido (FAA) de fijación es mejor que PFA para preservar la integridad de los tejidos de algunos tejidos recalcitrantes tales como brotes axialmente, raíces, etc. Sin embargo, PFA funciona mejor que la FAA en la preservación de la integridad del ARN. Por lo tanto PFA Se recomienda fijarmuestra para la hibridación in situ el trabajo (ISH). El protocolo descrito aquí está diseñado para el experimento ARN ISH. Por lo tanto, se prepararon todos los reactivos para evitar la degradación del ARN mediante la eliminación de la contaminación por RNasa tratamiento DEPC. Si la sección híbrido-Cut es para estudios anatómicos, agua regular de ósmosis inversa (OI) y su tampón o reactivos derivados son aceptables.
La reducción de tamaño de la muestra y el grosor de menos de 3 mm es útil para la infiltración. Por otra parte, el aumento del tiempo de inmersión para deshidratación e infiltración son necesarios para los tejidos de textura dura. Limitación de este protocolo podría Debido a los problemas causados por la fijación inadecuada, deshidratación, y la infiltración de la muestra. Por lo tanto, el ajuste del tiempo de procesamiento para cada paso es fundamental para producir bloques de parafina de buena calidad. Normalmente, el tejido más duro necesita más tiempo de procesamiento que el tejido más suave.
Además, puso de manifiesto que Hybrid-Cut trabajó con éxito en combinación wiTH ISH para proporcionar una distribución espacial de los transcritos seleccionados (Figura 7). En resumen, este protocolo es útil para el estudio de la anatomía de la planta y proporciona un mapa de ARN de tejidos específicos de los genes seleccionados. Además, puede aplicarse a otros estudios moleculares tales como ensayo de desoxinucleotidil transferasa terminal etiquetado final dUTP nick (TUNEL), hibridación in situ fluorescente (FISH), y las técnicas de inmunotinción. En conclusión, este protocolo seccionar los tejidos mejorada es útil y conveniente para los investigadores en las comunidades de plantas.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |