This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Behoud installatiesectie integriteit essentieel voor het bestuderen gedetailleerde anatomische structuren op cellulair, weefsel, of orgaan niveau. Echter, sommige plantencellen hebben starre celwanden, taai vezels en kristallen (calciumoxalaat, silica, etc.), en een hoog watergehalte dat vaak verstoren weefselintegriteit in plantenweefsel snijden.
Deze studie stelt een eenvoudige-Hybrid Cut weefsel snijden methode. Dit protocol wijzigt een paraffine gebaseerde snijden techniek en verbetert de integriteit van weefselsecties uit verschillende planten. Plantaardige weefsels werden ingebed in paraffine voor het snijden in een cryostaat bij -16 ° C. Snijden onder lage temperatuur verstokte paraffineblokken, verminderd scheuren en krassen, en verbeterde integriteit weefsel aanzienlijk. Dit protocol werd met succes toegepast op calciumoxalaat-rijke orchidee Phalaenopsis weefsels evenals recalcitrant weefsels zoals reproductieve organs en bladeren van rijst, maïs en tarwe. Bovendien kan de kwaliteit van de weefselsecties van hybride-Cut worden gebruikt in combinatie met in situ hybridisatie (ISH) ruimtelijke expressiepatronen van genen van belang. Kortom: dit protocol is vooral handig voor recalcitrante plantenweefsel met een hoog kristal of silica inhoud. Goede kwaliteit weefselcoupes in staat morfologische en andere biologische studies.
De paraffine gebaseerde snijden methode is een veel gebruikte techniek voor anatomische studies. Behoud van intact weefsel anatomie is belangrijk voor de morfologische en biologische studies. De in paraffine ingebedde coupes techniek is voordelig omdat paraffine-inbedding behoudt cel en weefsel morfologie. Bovendien kunnen paraffineblokken gemakkelijk worden opgeslagen voor langere tijd. Echter, in paraffine ingebedde coupes is niet geschikt voor plantenweefsels die intracellulaire kristallen. Kristallen in de cellen scheuren vaak paraffine linten en integriteit weefselschade tijdens het snijden.
In tegenstelling tot paraffine snijden, cryosectioning is relatief snel en secties kunnen worden verkregen zonder fixatie, seriële uitdroging of inbeddingmedium infiltratie 1. Cryosecties kunnen op tal van toepassingen zoals immunohistochemie, in situ hybridisatie en enzym histochemie. Het andere voordeel van cryosectioning isdat deze methode niet verder door middel van een mogelijke denaturatie processen, zoals hoge temperatuur en chemische behandelingen, zijn zo cellulaire moleculen goed bewaard gebleven in het weefsel secties 2. Cryosectioning het algemeen de voorkeur boven paraffine coupes basis voor studies in dierlijke weefsels. Echter, cryosectioning is niet de eerste keus in planten, omdat vriestemperatuur soms veroorzaakt vorming van ijskristallen die de kwaliteit van de afdeling integriteit aantasten. Hoewel osmoregulatie zoals sucrose oplossingen, polyethyleenglycol (PEG) of glycerol 3 is melding kristal ijsvorming te verminderen onder vorst, is de verbetering niet optimaal.
Aan te passen aan verschillende omgevingen, verschillende planten hebben vaak verschillende weefsel textuur en plantencellen zijn geëvolueerd tot starre celwanden, taai vezels, en kristallen 4,5 te vormen. Bijvoorbeeld, onoplosbare calciumoxalaatkristallen en silica lichamen zijn vrij algemeen in6 planten. Silicaat lichamen / kristallen zijn gemeld te helpen handhaven fabriek architectuur, oprechtheid, en ziekte of plaag te voorkomen dat in graangewassen 7-9.
De ingemaakte orchideeën en cut-bloemorchidee markt floreert en het is een groeiende industrie. Phalaenopsis Aphrodite (motten orchis) is een van de belangrijkste export sierplanten in Taiwan. Aanzienlijke inspanningen zijn gedaan om de morfologische en fysiologische veranderingen van de bloei processen Phalaenopsis begrijpen. Bloemen pieken van Phalaenopsis orchideeën zijn geïnitieerd vanuit oksel knoppen op het blad basis. Na een periode van koele omgevingstemperatuur (ongeveer anderhalve maand), okselknoppen vergroten, breken latentie en uitsteken van de bladbasis ontwikkelen tot jonge bloemen spikes. De fysiologische, cellulaire en moleculaire processen van spike initiatie begrijpen, is het essentieel om een sterke anatomische techniek ontwikkelen VisuaLize weefsels of markers in een tijdige wijze. De aanwezigheid van kristallen in alomtegenwoordige orchidee weefsels, met name in okselknoppen, maakt anatomische werk moeilijk.
Hier zochten we naar paragraaf integriteit van recalcitrant plantenweefsels die tot nu toe als technisch uitdagende beschouwd hebben te verbeteren. Hier laten we een verbeterde protocol genaamd Hybrid-Cut. Het is een paraffine gebaseerde snijden methode die wordt uitgevoerd met behulp van een cryostaat. Inbedden in paraffine lost hoog watergehalte in plantenweefsel. Snijden onder lage temperatuur verhardt het paraffine blok, vermindert crystal scheuren probleem, en verbetert de integriteit van het weefsel aanzienlijk. Dit protocol aanzienlijk verbetert weefsel integriteit voor recalcitrante planten monsters.
Plantencellen hebben starre celwanden, taaie vezels, kristallen, en een hoog watergehalte dat weefsel scheuren problemen tijdens plantenweefsel snijden veroorzaken. Hoewel paraffine gebaseerde snijden vaak wordt gebruikt voor plantenweefsels de endogene kristallen verscheuren vaak plantenweefsel tijdens het snijden (figuur 1). Vanwege de inherent hoog watergehalte in de plantencellen, cryostaat-gebaseerde snijden veroorzaakt vaak gebroken cellen en gebarsten weefselcoupes.
In de huidige studie, een gecombineerde paraffine-inbedding en cryosectie protocol genaamd Hybrid-Cut werd ontwikkeld en van goede kwaliteit weefsel secties werden verkregen. Dit protocol lost het probleem in verband met hoog watergehalte door invoering inbedden in paraffine en vermindert het scheuren effect door harding paraffine bij lage temperatuur tijdens het snijden (figuur 3). Daarom is deze gewijzigde protocol is voordelig ten opzichte van ofwel paraffine gebaseerde sectioning of cryosectioning voor het behoud van de integriteit van plantenweefsel.
Dit manuscript blijkt dat het hybride-Snijmethode behoudt weefselintegriteit in vele weefsels van orchidee Phalaenopsis zoals okselknop, zaad, en PLB, etc. die hoge kristallen (figuren 3-4) bevatten. Bovendien is dit protocol is ontvankelijk voor graangewassen zoals voortplantingsorganen en bladeren van rijst, maïs en tarwe die silica (figuren 5-6) bevatten. Vermoedelijk kan dit protocol worden gehanteerd voor installaties met een hoog vezel houtachtige.
In het algemeen, de vaststelling weefsel grondig is zeer belangrijk voor hybride-Cut. We vonden dat formaldehyde-alcohol-zuur zuur (FAA) fixatief is beter dan PFA aan het weefsel integriteit van een aantal recalcitrante weefsels te behouden, zoals axiaal knoppen, wortels, etc. Echter, PFA werkt beter dan FAA in het behoud van de RNA-integriteit. Daarom PFA wordt aanbevolen om vast te stellenmonster voor in situ hybridisatie (ISH) werk. De hier beschreven protocol is ontworpen voor RNA ISH experiment. Daarom werden alle reagentia bereid RNA afbraak door het elimineren RNase besmetting met DEPC behandeling te vermijden. Als Hybrid-Cut sectie is voor anatomische studies, regelmatige omgekeerde osmose (RO) water en daarvan afgeleide buffer of reagentia zijn aanvaardbaar.
Vermindering van specimen grootte en dikte tot minder dan 3 mm is nuttig voor infiltratie. Bovendien toenemende onderdompelingstijd voor dehydratatie en infiltratie nodig voor harde textuur weefsels. Beperking van dit protocol kunnen als gevolg van problemen veroorzaakt door onvoldoende fixatie, dehydratatie en infiltratie van specimen. Daarom aanpassing verwerkingstijd voor elke stap is kritisch voor goede kwaliteit paraffineblok produceren. Normaal gesproken moet harder weefsel langere verwerkingstijd dan zachtere weefsel.
Daarnaast hebben we laten zien dat de Hybrid-Cut werkte met succes in combinatie with ISH ruimtelijke verdeling van de geselecteerde transcripten (figuur 7) te verschaffen. Kortom, dit protocol is bruikbaar voor de studie van plantenanatomie en levert een weefselspecifieke RNA kaart van de geselecteerde genen. Bovendien kan het worden toegepast op andere moleculaire studies zoals terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) test, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en immunokleuring technieken. Tot slot, deze verbeterde weefsel snijden protocol is zowel nuttig en handig voor onderzoekers in plantengemeenschappen.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |